秈稻R996轉(zhuǎn)Pi9基因純系的篩選及稻瘟病抗性鑒定

潘素君，李魏,，高佳，戴良英, *

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

秈稻R996轉(zhuǎn)Pi9基因純系的篩選及稻瘟病抗性鑒定

潘素君a，李魏a,b，高佳b，戴良英a,b *

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將抗稻瘟病Pi9基因?qū)攵i稻品種R996，獲得轉(zhuǎn)基因植株，并對(duì)這些轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行遺傳分析。結(jié)果表明：Pi9基因已經(jīng)整合到受體細(xì)胞基因組中，并在轉(zhuǎn)錄水平上得到了有效表達(dá)；對(duì)轉(zhuǎn)基因植株后代進(jìn)行潮霉素抗性、GUS染色和PCR檢測(cè)分析，鑒定出Pi9基因陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；經(jīng)稻瘟病抗性鑒定，從T1代符合孟德?tīng)柗蛛x比(1∶2∶1)的分離群體中，成功篩選出轉(zhuǎn)Pi9基因的秈稻R996純系。

秈稻R996；Pi9基因；轉(zhuǎn)基因植株；稻瘟病抗性

1 材料和方法

1.1 材 料

R996轉(zhuǎn) Pi9基因植株；含 Pi9基因植株75–1–127；稻瘟病菌生理小種110–2。

1.2 方 法

1.2.1 潮霉素抗性篩選

選擇 T1代符合孟德?tīng)柗蛛x比(1∶2∶1)的轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)幾代繁殖篩選，獲得的單株成熟種子去殼，用體積比為 30%的次氯酸鈉溶液消毒處理 30 min，無(wú)菌水清洗5～6次后，將種子轉(zhuǎn)移到含有50 mg/L潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基中，置于26 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10 d后觀察篩選情況。

1.2.2 GUS 活性測(cè)定

轉(zhuǎn)基因水稻細(xì)胞中GUS基因的表達(dá)基本按文獻(xiàn)[12]的方法測(cè)定。以受體 R996的根和葉作染色對(duì)照，將經(jīng)過(guò)潮霉素篩選的轉(zhuǎn)基因植株的根和葉片剪取一小部分，放入 1.5 mL離心管中，加入適量X–Gluc染色液，在37 ℃恒溫箱中保溫過(guò)夜。倒掉染色液，用70%的乙醇脫色。

1.2.3 PCR檢測(cè)

按CTAB法提取經(jīng)過(guò)潮霉素篩選和GUS活性測(cè)定的轉(zhuǎn)基因苗和對(duì)照受體植株 R996的基因組DNA。PCR引物選用潮霉素抗性基因引物HPT–1F/HPT–1R，其擴(kuò)增引物序列為：HPT–1F，5′–TACCTCTACACAGCCATC–3′；HPT–1R，5′–TAT GTCCTGCGGGTAAAT–3′。擴(kuò)增片段大小為837 bp。分別以受體為陰性對(duì)照，以質(zhì)粒pCAMMBIA1301–Pi9為陽(yáng)性對(duì)照。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性50 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)37次；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的稻瘟病抗性鑒定

為檢測(cè)呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)Pi9基因R996植株是否具有稻瘟病抗性，用稻瘟病菌小種110–2對(duì)上述3種方法均鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)Pi9基因R996株系進(jìn)行噴霧接種，并以具有Pi9基因的植株75–1–127和受體R996為抗、感病對(duì)照。具體做法：將稻瘟病菌接種在燕麥片番茄汁瓊脂培養(yǎng)基上，于 26 ℃培養(yǎng) 7～10 d，用0.1‰的Tween20水溶液洗下分生孢子，接種孢子濃度約為2×105個(gè)/mL。清水浸種24 h，34～37 ℃催芽20 h左右至種子露白，播種后放入26 ℃的光照培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，幼苗長(zhǎng)到 3～4葉期時(shí)，進(jìn)行稻瘟病菌噴霧接種。接種后 26 ℃保濕暗培養(yǎng)24 h，然后光照培養(yǎng)7 d，調(diào)查發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)Pi9基因R996株系的潮霉素篩選結(jié)果

將受體和轉(zhuǎn)基因植株的種子消毒后，在潮霉素濃度為50 mg/L的1/2MS培養(yǎng)基中篩選，受潮霉素抑制，受體R996不萌發(fā)，而轉(zhuǎn)Pi9基因R996種子的根能正常生長(zhǎng)，還能長(zhǎng)出葉片(圖1)，說(shuō)明轉(zhuǎn)Pi9基因R996植株中由于具有hpt基因使植株具有潮霉素抗性。

圖1 潮霉素抗性篩選轉(zhuǎn)基因植株Fig.1 Screening of transgenic plants using hygromycin

2.2 GUS基因在轉(zhuǎn)Pi9基因R996植株中的瞬時(shí)表達(dá)

GUS染色結(jié)果顯示，R996轉(zhuǎn)Pi9基因植株后代株系的根呈明顯藍(lán)色(圖2–A)，而受體R996的根不顯色(圖2–B)。同樣，轉(zhuǎn)Pi9基因R996植株葉片被剪兩端也呈現(xiàn)藍(lán)色，中間部分葉片因蠟質(zhì)層阻擋，染色液難到達(dá)，所以基本無(wú)色(圖 2–C)。對(duì)照R996葉片被剪兩端沒(méi)有藍(lán)色(圖 2–D)。表明 GUS基因在轉(zhuǎn)基因植株后代中能高效表達(dá)，目的基因Pi9在后代中穩(wěn)定遺傳。2.3 轉(zhuǎn)Pi9基因R996植株的PCR檢測(cè)結(jié)果

圖2 轉(zhuǎn)基因植株GUS檢測(cè)Fig.2 Result of GUS detection of transgenic plants

由于Pi9基因同源片段在水稻基因組中廣泛分布，較難設(shè)計(jì)Pi9的特異引物，故選用潮霉素抗性基因引物。T1代表現(xiàn)為1∶2∶1孟德?tīng)柗蛛x規(guī)律的轉(zhuǎn)Pi9基因R996植株后代，經(jīng)PCR檢測(cè)均能擴(kuò)增出837 bp的特異條帶，表明轉(zhuǎn)Pi9基因的R996植株后代不再發(fā)生分離。這與 GUS染色和潮霉素篩選結(jié)果一致，即有 GUS顯色和潮霉素抗性的植株均可擴(kuò)增出837 bp的目的片段，而受體R996基因組DNA不能擴(kuò)增出該目的條帶(圖3)。

圖3 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.3 PCR result for transgenic plants

2.4 轉(zhuǎn)Pi9基因R996植株的稻瘟病抗性檢測(cè)

圖4 稻瘟病菌接種結(jié)果Fig.4 Result for rice blast inoculation test

轉(zhuǎn)Pi9基因R996植株的稻瘟病抗性檢測(cè)結(jié)果(圖4)表明，轉(zhuǎn)基因植株沒(méi)有出現(xiàn)明顯的稻瘟病病斑，對(duì)稻瘟病表現(xiàn)出強(qiáng)抗性。含有 Pi9基因的75–1–127植株葉片也沒(méi)有病斑，而受體R996病斑明顯，感病嚴(yán)重。

綜合上述 GUS染色、潮霉素抗性檢測(cè)、PCR分析以及稻瘟病抗性檢測(cè)結(jié)果，說(shuō)明Pi9基因不僅整合到轉(zhuǎn)基因植株的染色體上，而且成功在子代中穩(wěn)定遺傳，并表現(xiàn)出對(duì)稻瘟病的強(qiáng)抗性。

3 討 論

有研究[13]表明，稻瘟病廣譜抗性是持久抗性的重要組成部分。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，廣譜抗性基因在抗病育種中的應(yīng)用越來(lái)越重要。Pi9基因作為稻瘟病廣譜、持久抗源，目前相對(duì)水稻其他功能基因在育種上的應(yīng)用更有效、更廣泛。潘素君等[14]將Pi9基因?qū)攵i稻1701品種獲得的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)稻瘟病菌具有很強(qiáng)的抗性。梁海福等[15]利用常規(guī)回交育種結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，將高抗水稻白葉枯病Xa4和Xa23基因、廣譜高抗稻瘟病Pi9基因聚合到同一株系中，獲得了三基因聚合的純合株系，對(duì)稻瘟病的抗性與供體親本 75–1–127水平相當(dāng)。倪大虎等[16–18]利用分子標(biāo)記輔助選擇將廣譜高抗稻瘟病的 Pi9基因和高抗白葉枯病的 Xa21和Xa23基因聚合到優(yōu)良株系中，獲得了多抗基因的優(yōu)良新株系。文紹山等[19]將Pi9基因?qū)胨酒贩N瀘恢17，經(jīng)田間抗性鑒定，抗性基因純合株系的稻瘟病抗性比受體明顯提高。殷得所等[20]將Pi9基因通過(guò)雜交導(dǎo)入水稻品種揚(yáng)稻6號(hào)和R6547，經(jīng)病圃鑒定有Pi9基因株系的稻瘟病抗性水平較受體品種揚(yáng)稻6號(hào)和R6547有不同程度的提高。

本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Pi9基因?qū)攵i稻R996，通過(guò)GUS染色、潮霉素抗性篩選和PCR檢測(cè)，鑒定出轉(zhuǎn)基因植株的純合系。經(jīng)稻瘟病菌接種檢測(cè)表明，轉(zhuǎn)Pi9基因R996植株對(duì)稻瘟病抗性比受體R996明顯增強(qiáng)。下一步將選用高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)但抗性差的水稻品種與轉(zhuǎn)基因純合系進(jìn)行雜交育種，以期獲得抗稻瘟病新種質(zhì)。

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責(zé)任編輯：蘇愛(ài)華

英文編輯：羅 維

Screening of homozygous Pi9 gene transgenic lines of Indica cultivar R996 and identification of its rice blast resistance

PAN Su-juna, LI Weia,b, GAO Jiab, DAI Liang-yinga,b*
(a.Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province; b.College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128，China)

Pi9, the first cloned gene with broad-spectrum resistance to rice blast, was introduced into Indica cultivar R996 via Agrobacterium-mediated transformation. The subsequent genetic analysis showed that Pi9 was successfully introduced into the genome of the receptors, which displayed stable expression of Pi9 at transcription level. The offspring of the transgenic plants were analyzed by hygromycin resistance assay, GUS staining and PCR detection. And the homozygous Pi9/R996 transgenic lines were identified from the T1generation showing 1∶2∶1 Mendel segregation through rice blast resistance assay conducted on Pi9 positive transformants.

Indica cultivar R996; Pi9 gene; transgenic plant; the resistance of rice blast

10.13331/j.cnki.jhau.2014.06.005

投稿網(wǎng)址：http://www.hunau.net/qks

S511.2+10.34

A

1007?1032(2014)06?0589?04

稻瘟病是水稻的三大病害之一，常給水稻生產(chǎn)造成巨大的損失[1–3]。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗稻瘟病基因轉(zhuǎn)入優(yōu)質(zhì)的易感病的水稻品種中，通過(guò)雜交、回交等方法獲得高抗品系是減少稻瘟病病害的有效途徑之一。目前，在水稻的不同染色體上已定位了超過(guò)86個(gè)稻瘟病主效抗性基因，350個(gè)微效基因[2,4]。1999年，通過(guò)圖位克隆得到了第1個(gè)稻瘟病抗性基因Pib[5]。迄今，采用此方法已從不同的水稻品種中成功分離克隆了Pi9[6]、Pi2[7]、Pi1[8]、Pb1[9]等22個(gè)稻瘟病抗性基因[10]。稻瘟病菌生理小種的多樣性及稻瘟病與抗性基因之間的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系，限制了稻瘟病抗性基因和抗性品種的推廣應(yīng)用。

Pi9基因位于水稻第6號(hào)染色體短臂近著絲粒區(qū)域的Pi2/9位點(diǎn)，基因全長(zhǎng)約9.5 kb，包括2個(gè)長(zhǎng)度分別為5 362 bp和128 bp的內(nèi)含子，以及由3 099 bp的編碼區(qū)和910 bp 3' UTR組成的cDNA。Pi9編碼1個(gè)由1 032個(gè)氨基酸組成的蛋白產(chǎn)物。該產(chǎn)物羧基端含有富亮氨酸重復(fù)域(LRRs)，在氨基端含有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS)。目前，已證實(shí)Pi9基因?qū)?00多個(gè)稻瘟病菌小種具有抗性[6]。筆者采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Pi9轉(zhuǎn)入秈稻品種R996[11]，并進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因植株純系篩選以及稻瘟病抗性的鑒定，以期通過(guò)下一步遺傳雜交方法獲得高抗稻瘟病水稻新品種。

2013–06–23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371246，31300250)；轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2013ZX08001–002，2012ZX08009001)

潘素君(1973—)，女，湖南寧遠(yuǎn)人，博士，副研究員，主要從事分子生物學(xué)研究，sujunpan@163.com；*通信作者，daily@ hunau.net