建鯉IL–1β和IL–8基因?qū)崟r熒光定量RT–PCR檢測方法的建立

曾東，肖拉,2，倪學(xué)勤*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物微生態(tài)研究中心，四川 雅安 625014；2.樂山市市中區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，四川 樂山 614000)

建鯉IL–1β和IL–8基因?qū)崟r熒光定量RT–PCR檢測方法的建立

曾東1，肖拉1,2，倪學(xué)勤1*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物微生態(tài)研究中心，四川 雅安 625014；2.樂山市市中區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，四川 樂山 614000)

根據(jù)GenBank上的基因序列，在保守區(qū)設(shè)定并合成特異性引物，選擇β–actin作為內(nèi)參基因，采用SYBR Green I染料法，進行熔解曲線分析和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。熔解曲線表明，β–actin、IL–1β、IL–8的基因產(chǎn)物均為特異性產(chǎn)物，其Tm值分別為86、82.5和84 ℃；標(biāo)準(zhǔn)曲線表明，各基因Ct值的檢測范圍為12～32，擴增效率分別為96.3%，103.2%和102.6%，具有良好的線性關(guān)系，且r2均大于0.990；組內(nèi)變異系數(shù)分別為0.14%～0.86%，0.18%～0.93%和0.13%～0.86%；用建立的方法檢測健康建鯉頭、腎組織中IL–1β、IL–8的表達情況，相對表達量分別為1.09和1.71。綜合分析，建立的建鯉IL–1β、IL–8基因?qū)崟r熒光定量PCR方法具有檢測范圍廣，擴增效率高，特異性強，重復(fù)性高的特點，可用于建鯉IL–1β、IL–8基因的表達測定。

建鯉；IL–1β；IL–8；實時熒光定量RT–PCR

白細胞介素1β(interleukin–1β，IL–1β)和白細胞介素8(IL–8)分別作為重要的促炎因子和趨化因子，在硬骨魚類(Osteichthyes)免疫系統(tǒng)中起著重要的作用[1]。在一般狀況下，細胞因子的分泌量很低，或處于失活狀態(tài)，但在機體的免疫細胞或組織受到刺激發(fā)生新的基因轉(zhuǎn)錄后，其含量將會大幅度上升，通過與特殊細胞表面受體的高親和性結(jié)合，以協(xié)同形式結(jié)合其他細胞因子或抗病毒分子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[2]。

IL–1β和IL–8的基因表達水平在家畜、禽類及魚類上經(jīng)常用作機體免疫力的指示器，對其活化程度進行評價，可以了解疾病的發(fā)病機制[1,3–5]。目前國外對魚類基因表達的研究較多，如 I. E. Mulder等[3]研究感染沙門氏菌(Salmonella)的虹鱒(Oncorhynchus mykiss)腸道的IL–1β、IL–8基因時，發(fā)現(xiàn)它們的相對表達量均有所降低；S. F. Gonzalez 等[4]對感染寄生蟲的鯉魚(Cyprinus carpio L.)皮膚的IL–1β基因及D. H. Kim等[5]分別對益生菌共培養(yǎng)條件下虹鱒頭、腎細胞中的IL–1β、IL–8等基因進行研究時，發(fā)現(xiàn)它們的表達量均升高，說明細胞因子的表達量會因為不同刺激出現(xiàn)不同程度的升高或降低，調(diào)節(jié)魚體免疫功能。雖然魚類 IL–1β、IL–8的免疫功能已有部分報道[6–8]，但還沒有系統(tǒng)研究它們的表達情況。為了更好地評價魚類白細胞介素的免疫功能，準(zhǔn)確測定IL–1β和IL–8在組織中的表達量極其重要，有必要在分子水平上建立一種實時、快速、有效的檢測方法。

本試驗以健康建鯉(Cyprinus carpio var. Jian)為材料，選取β–actin為參考基因，以建立一種快速方便有效的實時定量PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗魚

體質(zhì)量約為(50.4±3.8) g的健康建鯉，購自四川雅安魚苗站。

1.1.2 主要儀器和試劑

CFX96實時熒光定量 PCR儀、MyCyclerTMThermal Cycler PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)Gel DocXR，均為美國Bio–Rad公司產(chǎn)品；冷凍高速離心機，為德國Thermo fisher公司產(chǎn)品。

天根 DP421 TRNzol A+總 RNA提取試劑；WM5–2302830 Phase Lock Gel Heavy；KR103–04 Quant cDNA第一鏈合成試劑盒；free–DNase/RNase水；2 000 bp DNA Maker；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank上建鯉的β–actin、IL–1β、IL–8基因序列，在各自的保守區(qū)設(shè)計特異引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列及產(chǎn)物大小見表1。

表1 建鯉β–actin、IL–1β和IL–8基因RT–qPCR擴增的引物序列及其產(chǎn)物大小Table 1 Primers used for the RT–qPCR for detection of β–actin, IL–1β, IL–8 of Jian carp

1.2 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

取健康建鯉頭、腎，用生理鹽水沖洗后，在研缽中加入液氮研磨。采用天根DP421 TRNzol A+總RNA提取試劑和 WM5–2302830 Phase Lock Gel Heavy組合提取總RNA。提取的RNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。提取到完整的RNA后，用天根KR103–04 Quant cDNA第一鏈合成試劑盒進行RNA反轉(zhuǎn)錄。所有操作均按照試劑盒說明書進行。反轉(zhuǎn)錄的cDNA于–20 ℃保存，備用。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以cDNA為模板，PCR擴增β–actin、IL–1β、IL–8基因。反應(yīng)體系為25 μL：SYBR Premix Ex TaqTM12.5 Ⅱ μL，上游引物1 μL(25 μmol/L)，下游引物1 μL (25 μmol/L)，cDNA 2 μL，RNase–free 水 8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 30 s；95 ℃ 變性5 s、62 ℃ 退火30 s、72 ℃延伸 15 s, 40個循環(huán)；最后4 ℃結(jié)束反應(yīng)。

1.4 實時熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

采用SYBR Green Ⅰ染料法，在CFX96實時熒光定量PCR儀進行擴增和數(shù)據(jù)分析，并對每個基因?qū)崟r熒光定量 PCR的反應(yīng)條件的退火溫度和引物濃度進行優(yōu)化。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒推薦的25 μL反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 12.5μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，RNase– free 水8.5 μL)。采用二步法(95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，Tm下處理30 s，40個循環(huán))，60 30 s℃ 上升到95 ℃，71個循環(huán)，獲得熔解曲線。退火溫度的優(yōu)化在引物的(Tm±5) ℃進行。引物濃度在0.2～1.0 μmol/L調(diào)整。比較每個基因在不同溫度和引物濃度下的Ct值、熒光強度及熔解曲線。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將標(biāo)準(zhǔn)品10倍系列稀釋，取10–4～10–10梯度為模板，采用以上優(yōu)化好的條件進行SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR，每個稀釋度設(shè)3個平行，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 重復(fù)性檢測

用建立好的實時熒光定量PCR方法，對6尾健康建鯉的頭腎樣品進行重復(fù)性檢驗，檢測樣品中β–actin、IL–1β和IL–8基因的Ct值。每個樣品設(shè)3個重復(fù)。算出Ct平均值，并計算其變異系數(shù)(CV)。

1.7 健康建鯉頭、腎中IL–1β和IL–8基因的相對表達量測定

用已建立的方法對 3個健康建鯉頭腎樣品中IL–1β和IL–8基因的相對表達量進行測定。每個樣品設(shè)3個重復(fù)。采用CFX96實時熒光定量PCR儀自帶分析系統(tǒng)(Pfaffl法)進行相對表達量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的提取效果

提取建鯉頭、腎的總RNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果(圖1)顯示，條帶(28S、18S)清晰可見，條帶間無明顯的拖尾現(xiàn)象，這表明RNA降解少，完整性良好。采用核酸紫外分析儀進行檢測，其OD260 nm/OD280 nm為1.91，說明RNA純度較好，符合RT–PCR的要求。

圖1 建鯉頭和腎組織的總RNAFig.1 Total RNA from head kidney of Jian carp

2.2 特異性分析結(jié)果

實時熒光定量RT–PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析(圖 2)表明，目的條帶長度符合預(yù)期大小，β–actin為152 bp，IL–1β為114 bp，IL–8為150 bp，且實時熒光定量熔解曲線(圖 3)分析結(jié)果均為特異性單峰，無引物二聚體等非特異性擴增產(chǎn)物，表明擴增的特異性好，產(chǎn)物為目的產(chǎn)物。β–actin、IL–1β 和IL–8等基因的目的產(chǎn)物的Tm值分別為86、82.5 和84 ℃。

圖2 建鯉β–actin、IL–1β、IL–8基因目的產(chǎn)物的RT–PCR結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of RT–PCR–amplified products forβ–actin, IL–1β, IL–8 of Jian carp

圖3 建鯉β–actin、IL–1β和IL–8目的產(chǎn)物的熔解曲線Fig.3 Melting curve of PCR–amplified products for β–actin, IL–1β, IL–8 of Jian carp

2.3 熒光定量PCR的優(yōu)化結(jié)果

如圖4和圖5所示：采用二步法，退火溫度為62 ℃，引物濃度為0.6 μmol/L時具有最小Ct值和最強的熒光吸收值。

圖4 不同退火溫度下β–actin、IL–1β和IL–8目的產(chǎn)物的Ct值和熒光吸收值Fig.4 Ct and fluorescence value of PCR–amplified products forβ–actin, IL–1β, IL–8 of Jian carp at different temperatures

圖5 不同引物濃度下β–actin、IL–1β和IL–8目的產(chǎn)物的Ct值和熒光吸收值Fig.5 Ct and fluorescence value of PCR–amplified products for β–actin, IL–1β, IL–8 of Jian carp at different primer concentrations

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將標(biāo)準(zhǔn)品進行 10倍系列稀釋，得到了均勻間距的擴增曲線，每個10倍稀釋的Ct值相差大約3.3，用7個稀釋度繪制相對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6)。標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果表明：β–actin、IL–1β和IL–8基因的Ct值的檢測范圍約為 12～32，擴增效率分別為 96.3%、 103.2%和102.6%，且相關(guān)系數(shù)r2均大于0.990。

圖6 建鯉β–actin、IL–1β和IL–8 SYBR Green I實時熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of SYBR Green I RT–qPCR amplified products for β–actin, IL–1β, IL–8 of Jian carp

2.5 穩(wěn)定性

采用已建立的方法，測定6個樣品的β–actin、IL–1β和IL–8基因的穩(wěn)定性結(jié)果分別見表2、表3和表 4。結(jié)果表明，此方法的穩(wěn)定性高，β–actin、IL–1β和 IL–8變異系數(shù)分別為 0.14%～0.86%、0.18%～0.93%和0.13%～0.86%。

表2 SYBR Green RT–qPCR 方法檢測β–actin基因表達的重復(fù)性Table 2 Repeatability of SYBR Green RT–qPCR for detection of β–actin expression

表3 SYBR Green RT–qPCR 方法檢測IL–1β基因表達量的重復(fù)性Table 3 Repeatability of SYBR Green RT–qPCR for detection of IL–1β expression

表4 SYBR Green RT–qPCR 方法檢測IL–8基因表達量的重復(fù)性Table 4 Repeatability of SYBR Green RT–qPCR for detection of IL–8 expression

2.6 IL–1β和IL–8的相對表達結(jié)果

采用已建立的方法，分析得到3個健康建鯉頭腎、樣品中IL–1β和IL–8基因的相對表達量分別為1.09和1.71。

3 討 論

IL–1β和IL–8是2種重要的細胞因子，廣泛表達于魚類的腎臟、脾臟、肝臟、腸道、皮膚等組織和器官中，其中作為重要免疫器官的頭腎和脾臟中的表達量較多，因此，眾多學(xué)者也將它們在頭腎和脾臟中的表達水平作為衡量魚類免疫功能的重要指標(biāo)之一[5,9–12]。

相對于蛋白質(zhì)檢測水平的 ELISA及分子檢測水平的Northern雜交、RNA酶保護試驗等檢測方法，RT–qPCR技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、自動化和重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、污染少等優(yōu)點，還能通過熔解曲線對產(chǎn)物的真?zhèn)魏图兌冗M行分析鑒定。本試驗選用 SYBR Green Ⅰ法，通用性好，能與所有雙鏈DNA結(jié)合產(chǎn)生熒光信號；靈敏度高，但容易產(chǎn)生非特異信號，所以對引物設(shè)計要求很高。在本試驗中，每一對引物都擴增得到了單一產(chǎn)物，說明引物符合試驗要求。在相對定量中，為了去除不同標(biāo)本在 RNA產(chǎn)量、質(zhì)量以及逆轉(zhuǎn)錄效率上可能存在的差別，選擇了表達相對恒定的內(nèi)參基因β–actin對測試樣本進行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，以校正作為模板的cDNA所存在的數(shù)據(jù)差異[13–14]。但是，由于β–actin基因的表達量也會受到外來刺激的影響，因此有學(xué)者建議采用2種或2種以上的參考基因[15–16]。為彌補本試驗只選取1個參考基因β–actin的不足，結(jié)合目的基因的擴增效率（E）來計算最后的結(jié)果，這樣能對目的基因真實的相對表達量起到較好的校正作用[17]。

本試驗在建立熒光定量PCR方法的過程中有2個優(yōu)勢(特點)，即進行了反應(yīng)體系的退火溫度和引物濃度的優(yōu)化，最后選擇了具有最小Ct值和最強熒光吸收值的反應(yīng)條件。評價標(biāo)準(zhǔn)曲線的優(yōu)劣有2個指標(biāo)，即相關(guān)系數(shù)r2和擴增效率E。r2表示標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性度，理想值應(yīng)大于 0.98，越接近 1, 說明其線性程度越好，定量越準(zhǔn)確；擴增效率E的理想值通常要在105%～95%，越接近 100%，說明其擴增效率越高[18]。在本試驗中，β–actin、IL–1β和IL–8 的r2分別為0.999，0.999和0.997，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性程度好，誤差??；E分別為96.3%、103.2%和102.6%，在理想范圍內(nèi)，大大降低了因擴增效率過低而造成的相對定量差異；所制作的3條標(biāo)準(zhǔn)曲線的 Ct值分別在 10.74～31.08、12.09～31.48和11.71～31.05 ℃，說明檢測范圍廣。Pfaffl認(rèn)為，當(dāng)實時熒光定量PCR 擴增目的產(chǎn)物時，如果Ct值變異系數(shù)小于 2.5%，則定量反應(yīng)結(jié)果可靠[17]。在本試驗中，β–actin、IL–1β和IL–8熒光定量PCR 擴增Ct值變異系數(shù)均小于1.0%，表明所建立的實時熒光定量PCR檢測這3個基因的表達重復(fù)性好，定量的結(jié)果可靠。因為mRNA轉(zhuǎn)錄的高動態(tài)性和樣品操作及下游處理步驟的多變性[19]，本試驗的所有操作和注意事項均按照實時熒光定量 PCR國際化標(biāo)準(zhǔn)—MIQE指南進行[20]，保證了建立檢測建鯉IL–1β 和IL–8基因表達方法的真實性和可靠性。

本試驗建立的檢測建鯉 IL–1β和 IL–8基因RT–qPCR的方法具有檢測范圍廣、擴增效率高、特異性強、重復(fù)性高的特點，可用于檢測建鯉IL–1β、IL–8基因的相對表達量。

[1] 陳旭衍，侯亞義．魚類細胞因子研究進展[J]．水生生物學(xué)報，2004，28(6)：668–673．

[2] Secombes C J，Hardie L J，Daniels G．Cytokines in fish：An update[J]．Fish Shellfish Immunol，1996，6(4)：291–304．

[3] Mulder I E，Wadsworth S，Secombes C J．Cytokine expression in the intestine of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) during infection with Aeromonas salmonicida [J]．Fish Shellfish Immunol，2007，23(4)：749–759．

[4] Gonzalez S F，Buchmann K，Nielsen M E．Real-time gene expression analysis in carp (Cyprinus carpio L.) skin：Inflammatory responses caused by the ectoparasite Ichthyophthirius multifiliis[J]．Fish Shellfish Immunol，2007，22(6)：641–650．

[5] Kim D H，Austin B．Cytokine expression in leucocytes and gut cells of rainbow trout，Oncorhynchus mykiss Walbaum，induced by probiotics[J]．Fish Shellfish Immunol，2006，114(3/4)：297–304．

[6] Castillo J，Teles M，Mackenzie S，et al．Stress-related hormones modulate cytokine expression in the head kidney of gilthead seabream (Sparus aurata)[J]．Fish Shellfish Immunol，2009，27(3)：493–499．

[7] Sigel M M，Hamby B A，Huggins E M．Phylogenetic studies on lymphokines：Fish lymphocytes respond to human IL–1 and epithelial cells produce an IL–1 like factor[J]．Vet Immunol Immunopathol，1986，12(1/4)：47–58．

[8] Kemenade B M L，Weyts F A A，Debets R，et al．Carp macrophage and neutrophilic granulocytes secrete an interleukin-1-like factor[J]．Dev Comp Immunol，1995，19(1)：59–70．

[9] Tanekhy M，Matsuda S，Itano T，et al．Expression of cytokine genes in head kidney and spleen cells of Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) infected with Nocardia seriolae[J]．Vet Immunol Immunopathol，2010，134(3/4)：178–183．

[10] Covello J M，Bird S，Morrison R N，et al．Cloning and expression analysis of three striped trumpeter (Latris lineata) pro-inflammatory cytokines，TNF–alpha，IL–1β and IL–8，in response to infection by the ectoparasitic，Chondracanthus goldsmidi[J]．Fish Shellfish Immunol，2009，26(5)：773–786．

[11] Fast M，Johnson S C，Jones S R M．Differential expression of the pro-inflammatory cytokines IL–1β–1，TNFα–1 and IL–8 in vaccinated pink (Oncorhynchus gorbuscha) and chum (Oncorhynchus keta) salmon juveniles[J]．Fish Shellfish Immunol，2007，22(4)：403–407．

[12] Sigh J，Lindenstr?m T，Buchmann K．Expression of proinflammatory cytokines in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) during an infection with Ichthyophthirius multifiliis [J]．Fish Shellfish Immunol，2004，17(1)：75–86．

[13] Gutierrez L，Mauriat M，Guénin S，et al．The lack of a systematic validation of reference genes：A serious pitfall undervalued in reverse transcription-polymerase chain reaction (RT–PCR) analysis in plants[J]．Plant Biotechnol J，2008，6(6)：609–618．

[14] Huggett J，Dheda K，Bustin S．Real-Time RT–PCR normalization，strategies and considerations[J]．Genes Immun，2005，6(4)：279–284．

[15] Schmid H，Cohen C，Henger A，et al．Validation of endogenous controls for gene expression analysis in micro dissected human renal biopsies[J]．Kidney Int，2003，64(1)：356–360．

[16] Vandesompele J，Preter K D，Pattyn F，et al．Accurate normalization of real-time quantitative RT–PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J]．Genome Biol，2002，3 (7)：research 0034.1–0034.11．

[17] Pfaffl M．A new mathematical model for relative quantification in real-time RT–PCR[J]．Nucleic Acids Res，2001，29(9)：2002–2007．

[18] Wong M L，Medrano J F．Real-time PCR for mRNA quantitation[J]．BioTechniques，2005，39：75–85．

[19] Garson J，Huggett J，Bustin S，et al．Unreliable real-time PCR analysis of human endogenous retrovirus-W (HERV–W) RNA expression and DNA copy number in multiple sclerosis[J]．AIDS Res Hum Retroviruses，2009，25(3)：377–378．

[20] Bustin S，Benes V，Garson J，et al．The MIQE guidelines：Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments[J]．Clin Chem，2009，55(6)：611–622．

責(zé)任編輯：蘇愛華

英文編輯：羅 維

Establishment of a real-time fluorescent quantitative RT–PCR for detection of IL–1β and IL–8 genes of Cyprinus carpio var. Jian

ZENG Dong1, XIAO La1,2, NI Xue-qin1*
(1.Animal Microecology Institute, College of Veterinary, Sichuan Agricultural University, Ya’an, Sichuan 625014, China; 2.Animal Disease Prevention and Control Center of Leshan City, Leshan, Sichuan 614000, China)

To establish a real-time fluorescent quantitative PCR assay for detection of IL–1β and IL–8 genes of Cyprinus carpio var. Jian, specific primers were designed according to the gene sequences available in GenBank, and the β–actin gene was used as a reference gene. The standard curve and the melting curve were analyzed through SYBR Green I method. Melting curve showed specific PCR products of β–actin, IL–1β and IL–8 gene were obtained with Tm86, 82.5 and 84 ℃ , respectively.Standard curve there were good linear relationship for β–actin, IL–1β and IL–8 (r2＞ 0. 990) under detecting Ctrange of 12 to 32. The amplification efficiency were 96.3%, 103.2%, and 102.6%, respectively, and the coefficients of variation (CV) of using this developed assay to detect these genes are 0.14%-0.86%, 0.18%-0.93% and 0.13%-0.86%, respectively. Relative expression value of IL–1β and IL–8 in healthy Cyprinus carpio var. Jian was 1.07 and 1.71, respectively. Conclusion: The developed real-time fluorescent quantitative PCR assay for IL–1β and IL–8 of Cyprinus carpio var. Jian, which showed broad range, high efficiency, specificity and reliability, could be used to detect IL–1β and IL–8 expression at mRNA level.

Cyprinus carpio var. Jian; IL–1β; IL–8; real-time fluorescent quantitative PCR (RT–qPCR)

10.13331/j.cnki.jhau.2014.06.013

投稿網(wǎng)址：http://www.hunau.net/qks

S941

A

1007?1032(2014)06?0627?06

2013–08–30

四川省科學(xué)技術(shù)廳國際合作項目(2013HH0055)；四川省學(xué)術(shù)帶頭人培養(yǎng)基金

曾東(1961—)，男，四川丹棱人，博士，教授，從事水產(chǎn)動物微生態(tài)研究，zend@sicau.edu.cn；*通信作者，xueqinni@foxmail.com