柑橘果實分泌囊發(fā)育與揮發(fā)油積累關(guān)系研究

梁社堅，梁錦堂，蔣寧雄，劉培衛(wèi)，吳 鴻

(1 華南農(nóng)業(yè)大學,亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣東 廣州510642； 2 中國科學院 華南植物園，廣東 廣州 510650)

柑橘果實分泌囊發(fā)育與揮發(fā)油積累關(guān)系研究

梁社堅1，梁錦堂1，蔣寧雄1，劉培衛(wèi)2，吳 鴻1

(1 華南農(nóng)業(yè)大學,亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣東 廣州510642； 2 中國科學院 華南植物園，廣東 廣州 510650)

【目的】揭示柑橘果實分泌囊發(fā)育與揮發(fā)油的積累關(guān)系，為陳皮的適時采收提供科學的形態(tài)學和植物化學依據(jù).【方法】運用石蠟切片、半薄切片法研究了陳皮果實及其分泌囊的發(fā)育過程；利用揮發(fā)油含量測定方法對果實發(fā)育過程中揮發(fā)油含量的變化進行了分析.【結(jié)果和結(jié)論】柑橘果實從5月開始發(fā)育到笠年1月成熟,由硬變軟.果皮顏色從深綠色變成金黃色或橙黃色，從不易剝離到極易剝離.分泌囊在外果皮中呈一輪排列且深淺不一，其發(fā)育過程分為4個階段.成熟的分泌囊具有帽區(qū)和球區(qū).后者中央有被2～5層上皮細胞包圍著的大的空腔，揮發(fā)油由上皮細胞分泌出來并貯存在空腔中.隨著果實的發(fā)育，揮發(fā)油的積累呈現(xiàn)“S”型的變化趨勢.揮發(fā)油含油率在5—8月是一個平緩上升的時期，9—11月是一個快速增長期，11月中旬到達頂峰，12月初開始略微地下降.陳皮應(yīng)以柑橘果實的外果皮為最佳入藥部位.陳皮的最佳采收時期應(yīng)為11月末到12月初，此時果實顏色為淺黃色或金黃色，分泌囊空腔平均直徑最大(200 μm左右)，揮發(fā)油含油率最高(8.2%～8.5%).

陳皮； 柑橘； 分泌囊； 揮發(fā)油

陳皮是蕓香科(Rutaceae)柑橘CitrusreticulataBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮.柑橘果實扁球形，果皮薄易剝離.果皮中有較大的點狀油室，對光照視，透明清晰[1]，此即為果皮中分泌囊.分泌囊是蕓香科植物普遍具有的結(jié)構(gòu)特征，也是其揮發(fā)油產(chǎn)生的主要部位[2].分泌囊分泌的揮發(fā)油能驅(qū)蟲、抗病菌[3- 4]，具有化學防御的作用[5].另外，陳皮揮發(fā)油具有平喘、鎮(zhèn)咳和抗炎等功效[6]，也具有抗腫瘤的活性[7].關(guān)于柑橘屬分泌囊的起源、發(fā)育方面的研究已有不少報道.Heinrich[8-9]認為柑橘屬分泌囊的起源、發(fā)育是溶生型，而Turner等[10]認為是裂生型；近年來，我們利用酶細胞化學和細胞程序化死亡研究方法證明柑橘屬幾種植物的分泌囊空腔的發(fā)育方式均為裂溶生型[11-13].另外，我們在廣佛手Citrusmedica果實發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn)，分泌囊的結(jié)構(gòu)發(fā)育與果實發(fā)育密切相關(guān)，且直接影響著揮發(fā)油的產(chǎn)量[14].陳皮是柑橘的干燥成熟果皮，也是有效成分揮發(fā)油積累部位.因此，研究其果實發(fā)育過程中揮發(fā)油含量的積累和變化規(guī)律與果實分泌囊發(fā)育的關(guān)系，可為柑橘的適時采收提供科學的形態(tài)學指標和植物化學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

2009年5月—2010年1月和2010年5月—2011年1月，分別在每個月定期取華南農(nóng)業(yè)大學苗圃栽種的柑橘果實，經(jīng)華南農(nóng)業(yè)大學寧熙平副教授鑒定為柑橘CitrusreticulataBlanco.每次取樣50個，并及時取皮陰干，小果不剝皮直接陰干.干燥后測得平均含水量約為10%，在-10 ℃的條件下密封保存.

1.2 方法

1.2.1 揮發(fā)油含量測定法 稱取不同時期的柑橘干片約30 g，粉碎，置于蒸餾裝置的燒瓶中，加入300 mL蒸餾水和1.5 g NaCl加熱至沸，并保持微沸5 h，記錄揮發(fā)油量.每試驗重復(fù)3次，取平均值.

1.2.2 石蠟切片法 取幼小的柑橘果實，用FAA固定，乙醇系列脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，美國AO切片機切片，切片厚8～10 μm,番紅-固綠對染，中性樹膠封片，Lecia DMLB顯微鏡觀察并照相.

1.2.3 半薄切片法 取不同時期的柑橘果皮，分割成0.5 mm×0.5 mm×1.0 mm的小塊，固定于體積分數(shù)為5%的戊二醛(0.1 mol/L磷酸緩沖液配制，pH7.2)中，低溫(4 ℃)固定4 h，緩沖液沖洗，用質(zhì)量濃度為10 g/L的鋨酸室溫后固定2 h，蒸餾水沖洗，系列乙醇脫水，環(huán)氧丙烷過渡，Epon812包埋，奧地利Reichert Jung超薄切片機切片，切片厚1～2 μm，甲苯胺藍TBO染色，Leica DMLB顯微鏡觀察并照相.

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘果實發(fā)育及揮發(fā)油積累規(guī)律

不同月份柑橘果實發(fā)育形態(tài)特征變化情況見表1、圖1.柑橘春季開花，5月份花瓣凋落，果實很小，扁球形.果皮呈深綠色，不容易剝離.6—8月果實逐漸增大，果皮仍為深綠色，多條棱明顯可見.9—10月份柑橘生長速度最快，果皮漸漸變得光滑，顏色呈淺綠色.11—12月份果實生長緩慢，但果皮的黃色越來越多，逐漸取代綠色.到笠年1月份果實變成金黃色或橙黃色，果皮薄極易剝離，明顯可見透明的腺點.

表1不同月份柑橘果實發(fā)育形態(tài)特征變化

Tab.1ChangesinmorphologicalfeaturesduringCitrusreticulatafruitdevelopmentindifferentmonths

月份采樣日期顏色 性狀506-09墨綠色硬606-29墨綠色硬708-03深綠色硬808-29青色微軟909-27青色微軟1010-27青色帶黃軟1111-30淺黃色軟1212-31金黃色軟101-10橙黃色松軟

對每月定期采集的果實進行揮發(fā)油含量測定結(jié)果(圖2)表明，柑橘揮發(fā)油的含油率隨著果實生長時間呈“S”型的變化趨勢，具體可以分為3個時期:1) 5—8月為揮發(fā)油含量緩慢增長期，此階段揮發(fā)油含油率很低，說明果實主要進行生長發(fā)育，只積累少量揮發(fā)油；2) 9—12月初是揮發(fā)油含量的快速增長期，特別是10—11月，增長速度尤為突出，到11月中旬時達到頂峰，說明此階段果實主要積累揮發(fā)油；3) 12月初至翌年1月為揮發(fā)油緩慢下降期，此時柑橘果實慢慢成熟，到1月底完全成熟，揮發(fā)油的含量有所下降.

圖1 柑橘果實發(fā)育過程Fig.1 The development of fruit of Citrus reticulata

圖2 不同月份柑橘果實揮發(fā)油含量的變化規(guī)律

Fig.2 The change of essential oil duringCitrusreticulatafruit development in different months

2.2 果實發(fā)育過程中的內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化

從早期子房的縱切面可見，每個子房室里有1～2個胚珠發(fā)育(圖3a).子房的橫切面呈圓形，子房壁較厚(圖3b).開花后，花萼和花冠枯萎脫落，雄蕊和雌蕊的柱頭也凋謝，子房壁發(fā)育成果皮.

隨著柑橘果實的發(fā)育，子房內(nèi)壁的部分表皮細胞快速垂周分裂，形成幾個緊挨著的窄長細胞群，此處的表皮細胞與周圍其他表皮細胞區(qū)別較大，細胞體積增大，細胞質(zhì)濃厚，染色較深，此為汁囊原基(圖3c).這些細胞群和其下面的表皮細胞一起，進行平周分裂和垂周分裂，產(chǎn)生一個個向子房室內(nèi)的柱狀突起(圖3d).隨后汁囊原基細胞進一步發(fā)育為絨毛狀的肉瓢，汁囊不斷伸長膨大，最終發(fā)育成柑橘的可食用部位.

柑橘的胚珠是由胎座表皮下層細胞多次分裂，形成一團突出的細胞，形成胚珠原基，胚珠原基逐步發(fā)育分化出內(nèi)、外2層珠被及發(fā)達的珠心組織(圖3e).大多數(shù)的胚珠敗育(圖3f)，只有少數(shù)胚珠最終形成種子(圖3e).

2.3 果皮分泌囊的發(fā)育過程

分泌囊是揮發(fā)油產(chǎn)生的主要部位.從柑橘果皮表面上肉眼可看到很多呈疣狀突起的亮點(圖1)，其內(nèi)部即為分泌囊.成熟果實橫切面上分泌囊排列為一圈，其大小不等(直徑為100～300 μm)，分布的部位深淺不一(圖4b).根據(jù)分泌囊發(fā)育過程中細胞形態(tài)的變化特點判斷，可將分泌囊的發(fā)育過程分為4個階段，即分泌囊原始細胞階段、分泌囊胞間隙形成階段、分泌囊空腔擴大階段和分泌囊成熟階段.

a：柑橘早期子房的縱切面, 每個子房室里有1～2個胚珠(箭頭)： b：幼果的橫切面呈圓形，分泌囊(箭頭)分布在外果皮，大小、深淺不一； c：內(nèi)果皮表面突起形成汁囊原基(箭頭)，其細胞染色較深；d： 汁囊形成柱狀突起(箭頭)； e：可育的胚珠； f： 胚珠敗育.a、b標尺=1 mm; c標尺=100 μm; d、e、f標尺=200 μm.

圖3 柑橘果實的石蠟切片
Fig.3 Praffin sections ofCitrusreticulatafruit

分泌囊原始細胞階段:由于細胞分裂不均勻，形成多個由大小不等的數(shù)十個細胞組成的細胞團，其形態(tài)呈圓形或橢圓形,細胞彼此鑲嵌.與周圍細胞相比，分泌囊原始細胞體積較小，但細胞核大，細胞質(zhì)濃厚(圖4a).

分泌囊胞間隙形成階段：隨著分泌囊發(fā)育，原始細胞團逐漸形成2個區(qū)，即圓錐狀的帽區(qū)和圓球形的球區(qū).在球區(qū)2～3個中央細胞之間的細胞壁局部膨脹，細胞的角隅處出現(xiàn)裂縫，此時，中央細胞的細胞質(zhì)依然濃厚，但細胞核逐漸移到細胞邊緣.之后，裂縫沿著細胞壁擴展，在中央細胞間形成由4～5個細胞圍繞的小腔隙(圖4b).

分泌囊空腔擴大階段：此期，上皮細胞的細胞質(zhì)逐漸變淡，出現(xiàn)液泡化.部分上皮細胞與相鄰細胞間發(fā)生分離，細胞逐漸破毀.上皮細胞的溶解可逐漸由內(nèi)向外進行，最終僅僅1～2層上皮細胞保存.通過這一系列變化，導(dǎo)致了腔隙進一步擴大.帽區(qū)呈圓錐狀，由薄壁細胞構(gòu)成，與表皮細胞相連，果皮往往在此處發(fā)生內(nèi)陷(圖4c).

分泌囊成熟階段：隨著果實的生長，分泌腔繼續(xù)增大，一般當直徑達200 μm左右時，分泌囊即達成熟階段，明顯分為球區(qū)和帽區(qū).其中球區(qū)含有由3～6層扁平切向延長的上皮細胞包圍的分泌腔，其中還可見到破毀的上皮細胞.上皮細胞外圍又由5～8層更為扁平的鞘細胞包圍，液泡化程度較上皮細胞的高(圖4d).

a： 原始細胞階段，形成細胞團； b： 胞間隙形成階段，分成帽區(qū)(C)和球區(qū)，后者細胞群中形成胞間隙(箭頭)； c： 空腔擴大階段，上皮細胞(E)和鞘細胞(Sh)切向延長，靠近空腔(L)的上皮細胞破毀； d： 成熟階段，空腔(L)進一步擴大，上皮細胞(E)恢復(fù)完整，外圍由5～8層更為扁平的鞘細胞(Sh)包圍. a、b、c中，標尺=40 μm; d中，標尺=100 μm.

圖4 分泌囊的發(fā)育過程
Fig.4 Developmental process of secretory cavity

3 討論與結(jié)論

陳皮是柑橘的干燥成熟果皮[1]，有效成分揮發(fā)油主要產(chǎn)生和儲藏于果皮的分泌囊中[14].通過對柑橘的果皮結(jié)構(gòu)組成進行詳細觀察，發(fā)現(xiàn)柑橘果皮中分泌囊通常分布在外果皮中，成一輪排列且深淺不一.中果皮由大型的薄壁細胞組成，間有維管束分布.內(nèi)果皮形成8～12個果瓣，內(nèi)有汁囊和1～2個種子.從古代開始，陳皮的凈選就有“去瓤、去赤脈、去白”，但也有“留白” 之說[15].如今，人們在制作陳皮的時候，往往把果瓣丟棄，保留整個果皮曬干后密封保存[16].我們研究發(fā)現(xiàn)柑橘的中果皮主要由薄壁細胞組成，含水分較多，容易發(fā)霉，且無分泌囊形成，因此不宜作為陳皮的原料.而外果皮分布有豐富的分泌囊，其內(nèi)含有大量的揮發(fā)油和其他有效成分，應(yīng)該是陳皮的最佳原料部位，將其單獨曬干，不僅容易干透，又有利于陳皮的保存和提高陳皮的藥效.

在生產(chǎn)實踐中，由于果農(nóng)在采收時節(jié)，不論果實大小和顏色，一律采下剝皮曬干，直接出售到藥材市場.這樣就導(dǎo)致了中藥陳皮的質(zhì)量參差不齊，藥效降低.因此，制定科學的柑橘果實采收的形態(tài)和結(jié)構(gòu)指標十分重要.對每月定期采集的果實進行揮發(fā)油含量測定分析，結(jié)果表明，柑橘果實揮發(fā)油的含油率隨著果實發(fā)育呈“S”型的變化趨勢：先緩慢增加，再快速增長到頂峰，最后緩慢下降.這結(jié)果與先前研究廣佛手揮發(fā)油隨果實發(fā)育變化趨勢[14]一致.說明具有分泌囊的柑橘屬植物的果實一開始先進行多糖的積累，果實迅速增大，果皮中揮發(fā)油積累很少.在成熟的過程中，果實中的物質(zhì)開始轉(zhuǎn)化成揮發(fā)油，果皮中含油率不斷增高，最終到達頂峰. 因此，提取柑橘揮發(fā)油的最佳時機是揮發(fā)油含量最高的時期——柑橘將要成熟的11月末，此時柑橘果實的顏色是淺黃色.但是柑橘成熟之后揮發(fā)油含量的下降并不十分明顯，考慮到綜合的經(jīng)濟效益，柑橘完全成熟時果皮最重，果皮顏色為金黃色，此時采收也是較佳時期.柑橘成熟以后，果皮顏色慢慢變成暗黃色，其含油率再次下降.究其原因此時果實分泌囊已進入衰老階段，不再進行揮發(fā)油的積累，反而逐漸向空氣中散發(fā)揮發(fā)油.由此可見，果實顏色為淺黃色和金黃色時，揮發(fā)油含量最高，此外部形態(tài)特征可做為陳皮采收時期的外部特征依據(jù).然而，由于果實的外部形態(tài)特征容易受外界環(huán)境的影響，而揮發(fā)油的變化規(guī)律與分泌囊空腔的發(fā)育程度和結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān)[14].本研究發(fā)現(xiàn)，柑橘的分泌囊發(fā)育過程分為4個階段：原始細胞階段、胞間隙形成階段、空腔擴大階段和成熟階段，其發(fā)育方式為裂溶生，為證明柑橘屬植物的分泌囊空腔的發(fā)生方式均為裂溶生型[11-13]提供新的細胞學資料.隨著分泌囊發(fā)育，空腔逐漸擴大，揮發(fā)油含量也越來越高.當分泌囊發(fā)育成熟，其空腔直徑平均達到200 μm左右時，空腔幾乎達到最大直徑，揮發(fā)油含量也達到頂峰,此期,果實顏色正好為淺黃色或金黃色.因此，分泌囊空腔的發(fā)育程度和結(jié)構(gòu)特征同樣可作為果實適時采收的內(nèi)部結(jié)構(gòu)指標.

結(jié)合果實發(fā)育的顏色變化、揮發(fā)油含油率的變化規(guī)律和分泌囊空腔的結(jié)構(gòu)發(fā)育特征，可為陳皮適時采收提供外部形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)和植物化學三方面的綜合指標.我們認為陳皮的最佳采收時期應(yīng)為11月末到12月初，此時果實顏色為淺黃色或金黃色，分泌囊空腔平均直徑最大(200 μm左右)，揮發(fā)油含油率最高，達到8.2%～8.5%.

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【責任編輯李曉卉】

TherelationshipbetweensecretorycavitydevelopmentandaccumulationofessentialoilsinfruitofCitrusreticulata

LIANG Shejian1, LIANG Jintang1, JIANG Ningxiong1, LIU Peiwei2, WU Hong1

(1 State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;2 South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China)

【Objective】 The study of secretory cavity development and essential oil in the fruit ofCitrusreticulatamay provide scientific basis of morphology and phytochemistry for timely harvest of Chenpi. 【Method】The developmental processes of fruit and secretory cavity were studied by paraffin section and semi-thin section method. The change of essential oil during fruit development was quantitatively analyzed. 【Result and conclusion】 From May to January, the fruit ofC.reticulatadeveloped from hard and dark green to soft and golden yellow or orange. In the epicarp, the secretory cavities were distributed in a ring with different depths. The developmental processes of secretory cavity were divided into four stages. The secretory cavity was shown to be composed of two areas: a cap area and a circular area. In the center of the latter, one big cavity was surrounded by 2-5 layers of epithelial cells. Essential oil secreting from the epithelial cells was stored in this cavity. With the fruit development, the accumulation of essential oil followed a “S” trend. The ratio of essential oil displayed a gentle rise during the period from May to August, a rapid growth from September to November, reaching a peak in the middle of November, and a slight decline in early December. It is suggested that the medically effective fraction of Chenpi is the epicarp. The best time for harvest should be from late Novermber to early December. In this period, the fruit color is light yellow or golden yellow. The average diameter of secretory cavities reaches the maximum (200 μm), and the ratio of essential oils is also the highest (8.2%-8.5%).

Chenpi;Citrusreticulata; secretory cavity; essential oil

2013- 03- 20優(yōu)先出版時間2014- 01- 03

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20140103.0831.029.html

梁社堅(1978—)，男，講師，博士,E-mail:liangshejian@scau.edu.cn；通信作者：吳 鴻(1963—)，男，教授，博士，E-mail：wh@scau.edu.cn

國家自然科學基金 (31100240, 31070159, 31171919)

梁社堅，梁錦堂，蔣寧雄，等.柑橘果實分泌囊發(fā)育與揮發(fā)油積累關(guān)系研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報，2014,35(2):61- 65.

Q944.59

A

1001- 411X(2014)02- 0061- 05