新型胰島素增敏劑的合成及其生物活性評價*

宋云龍，何新華，樊士勇，史衛(wèi)國，賈紅心，仲伯華

(1.中國人民解放軍 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 毒物藥物研究所，北京 100850;2.中國人民解放軍 第二炮兵總醫(yī)院 藥學(xué)部,北京 100088)

·研究論文·

新型胰島素增敏劑的合成及其生物活性評價*

宋云龍1,2，何新華1，樊士勇1，史衛(wèi)國1，賈紅心1，仲伯華1

(1.中國人民解放軍 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 毒物藥物研究所，北京 100850;2.中國人民解放軍 第二炮兵總醫(yī)院 藥學(xué)部,北京 100088)

以川芎嗪為結(jié)構(gòu)單元，與噻唑烷二酮類降糖藥物的藥效團組合，設(shè)計并合成了一個新的胰島素增敏劑——2-甲氧基-5-[(2,4-二氧代-5-噻唑烷基)-甲基]-N-[(3,5,6-三甲基-2-吡嗪基)-甲基]-苯甲酰胺(Ⅰ),其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和MS表征。體外活性測試結(jié)果表明，Ⅰ在用藥量為1×10-5mol·L-1時對PPAR-γ的激動活性與吡格列酮相當(dāng)；體內(nèi)生物活性測試結(jié)果表明，Ⅰ有抑制血糖升高的傾向,有一定的血管內(nèi)皮細胞保護作用。

噻唑烷二酮；胰島素增敏劑；激動劑；合成；生物活性

以吡格列酮(Pioglitazone)、羅格列酮為代表的格列酮類藥物是PPAR-γ特異性高親和力配體，通過提高骨骼肌和脂肪細胞對葡萄糖吸收和降低肝糖的輸出來提高細胞對胰島素的敏感性，改善胰島素的抵抗狀態(tài)，從而全面兼顧糖尿病高血糖、高胰島素血癥、胰島β細胞受損、胰島生理功能失活這4個病變環(huán)節(jié)，超越單一控制血糖的局限，全面控制糖尿病。但是,由于具有水腫、體重增加以及心血管方面的副作用[1-2]，羅格列酮已從歐盟市場撤出，吡格列酮的應(yīng)用也受到限制。

PPAP-α激動劑可以促進肝臟脂類的氧化代謝，與PPAR-γ激動劑有協(xié)同作用。因此，PPAR-α/γ雙重激動劑能較好地解決PPAR-γ激動劑帶來的病人體重增加等問題，列扎類化合物muraglitazar,Tsaglizazar及噻唑烷二酮類化合物KRP-297就是這樣一類藥物，它們可以改善肝脂代謝失調(diào)和提高對胰島素的敏感性，但是因為在Ⅲ期試驗階段中顯示具有心血管方面的副作用或者能夠誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)腫瘤的產(chǎn)生，該類藥物均終止了研發(fā)?？朔葝u素增敏劑類藥物的副作用，是該類藥物研發(fā)的瓶頸。

川芎嗪(四甲基吡嗪,1)對心血管系統(tǒng)有多方面的藥理作用,包括保護血管內(nèi)皮細胞[3]、抗血小板聚集[4-5]、清除自由基[6-7]等。

通過對噻唑烷二酮類化合物的逆合成分析，本文以1為結(jié)構(gòu)單元，與噻唑烷二酮類降糖藥物的藥效團組合，設(shè)計并合成了一個新的噻唑烷二酮類化合物——2-甲氧基-5-[(2,4-二氧代-5-噻唑烷基)-甲基]-N-[(3,5,6-三甲基-2-吡嗪基)-甲基]-苯甲酰胺(Ⅰ,Scheme 1),其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和MS表征。并對其生物活性進行了評價。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

JNM-ECA-400400MHz型超導(dǎo)核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標)；API3000型電噴霧質(zhì)譜儀。

(Z)-2-甲氧基-5-[(2,4-二氧代-5-噻唑烷基)-亞甲基]-苯甲酸甲酯(7)和2-甲氧基-5-[(2,4-二氧代-5-噻唑烷基)-甲基]-苯甲酸甲酯(8)按文獻[8]方法合成；硅膠GF254和柱層析硅膠(200目～300目，300目～400目)，青島海洋化工廠；其余所用試劑均為分析純，溶劑按常規(guī)方法經(jīng)干燥處理。

1．2 合成

(1)2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪(2)的合成

在單口燒瓶中依次加入17.2g(53mmol)，N-溴代丁二酰亞胺(NBS)12.0g(53mmol)，四氯化碳120mL及催化量過氧化苯甲酰，攪拌下光照回流反應(yīng)12h。濃縮后經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：A=V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶3]純化得淡黃色液體24.0g，收率35%。

(2)N-[(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)-甲基]-鄰苯二甲酰亞胺(3)的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入24.0g(18.7mmol)，DMF 50mL和鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽5.0g，攪拌下于90℃反應(yīng)5h。用水洗滌、無水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑得34.8g，收率92.3%。

(3)2-氨基甲基-3,5,6-三甲基吡嗪(4)的合成

在反應(yīng)瓶中加入34.8g和乙醇100mL,攪拌使其溶解；加入水合肼3mL，回流反應(yīng)至終點(隨反應(yīng)進行有白色固體產(chǎn)生)。過濾除去不溶物，濾液濃縮后經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=2∶1)純化得黃色油狀液體42.6g，收率61%。

(4)2-甲氧基-5-甲?；郊姿峒柞?6)的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入2-羥基-5-甲?；郊姿?5)5.0g(30mmol)，三苯基磷15.6g(60mmol)，甲醇2.0g(62.5mmol)及THF 100mL,攪拌使其溶解；氮氣保護，冰浴冷卻至0℃，緩慢滴加偶氮二甲酸二乙酯(DEAD)9.2mL(60mmol)的THF(80mL)溶液(0.5h)，滴畢，于室溫反應(yīng)10h。濃縮后經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=1∶1)純化得白色固體65.5g，收率94.8%。

(5)Ⅰ的合成

在反應(yīng)瓶中加入80.41g(1.5mmol)和DMF 30mL,攪拌使其溶解；依次加入三乙胺0.45g(4.5mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)0.57g(3mmol)，1-羥基苯并三唑(HOBt)0.20g(1.5mmol)，于室溫反應(yīng)10min。加入40.23g(1.5mmol)，于室溫反應(yīng)8h。減壓蒸除DMF，加50mL水，用乙酸乙酯(3×25mL)萃取，合并有機相，用無水硫酸鈉干燥后經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(DCM)∶V(MeOH)=10∶1]純化得白色固體0.33g，收率54%；1H NMRδ: 12.0(s,1H,CONHCO),9.290(t,J=4.4Hz,1H,CONH),7.161～7.838(m,3H,ArH),4.913(dd,J=4.8Hz,8.8Hz,1H,b-H),4.586(d,J=4.4Hz,2H,a-H),3.994(s,3H,OCH3),3.346(dd,J=8.4Hz,14.0Hz,1H,c-H),3.169(dd,J=8.4Hz,14.0Hz,1H,c-H),2.456～2.505(m,9H,ArCH3)；ESI-MSm/z: 415.5{[M+H]+}。

1．3 生物活性測試

(1)PPAR-γ的受體激動活性

[9]方法進行PPAR-γ的受體激動活性測試。陽性對照為吡格列酮，溶劑對照值為1，實驗結(jié)果用相對激活倍數(shù)表示，值越大激活能力越高。

(2)葡糖糖耐量實驗(OGTT)

受試動物: 昆明種小白鼠18g～22g,雌雄各半,飼用商業(yè)飼料,任意飲水。在實驗室適應(yīng)3d后,取體表無損傷、一般情況好、反應(yīng)靈活的小鼠用于實驗。

受試藥物: 受試化合物均以生理鹽水及吐溫配成混懸液，給藥體積0.2mL/10g,給藥量10mg·kg-1,灌胃給藥,每天一次。

葡萄糖耐量實驗方法[10]：取體健小鼠隨機分為以下各組(10只/組,雌雄各半),生理鹽水對照組,吡格列酮組和Ⅰ組,各組給藥劑量均為10mg·kg-1,連續(xù)給藥7d,至末次給藥后當(dāng)晚起,小鼠禁食約12h,次日分別在糖負荷前和糖負荷后1h和2h,經(jīng)小鼠尾靜脈取血,血糖儀測定糖負荷前后的血糖濃度。

(3)胰島素耐量實驗

按1.3(2)取小鼠分為3組(10只/組,雌雄各半),連續(xù)給藥14d。至末次給藥當(dāng)日晚至次晨空腹約12h,經(jīng)眼眶靜脈叢取血后,各組立即予以胰島素負荷0.2μ·kg-1皮下注射,注射1h和2h后,取血樣,按上述方法測定胰島素負荷前后小鼠血糖的變化。

(4)血管內(nèi)皮細胞保護實驗

藥液配制：以DMSO為溶劑，配置c(Ⅰ)為100mmol·L-1;使用c(Ⅰ)：(0，0.1，1，10，100)×10-6mol·L-1，儲存于-20℃?zhèn)溆?；過氧化氫的配制:先吸8.3μL 30%H2O2溶液加到1mL滅菌去離子水中，從中取10μL加入到2mL培養(yǎng)基中，配成4×10-4mol·L-1的濃度溶液。使用濃度2×10-4mol·L-1，作用4h。

細胞存活實驗(CCK-8實驗)實驗方法:以3×103細胞/孔的起始濃度在96孔板中接種HUVEC細胞，每孔加入100μL RPMI 1640培養(yǎng)基。于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；每孔分別加入不同濃度[(0，0.1，1，10，100)×10-6mol·L-1]藥液，每個濃度做6個復(fù)孔。同時設(shè)不加藥液的對照孔。藥液處理12h后，加入2×10-4mol·L-1H2O2，作用4h 后，吸出培養(yǎng)基，并用新鮮的培養(yǎng)基洗2次；每孔加入100μL新鮮的無血清培養(yǎng)基(含1/10CCK8試劑)，于37℃孵育4h。用加了相應(yīng)量細胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照；在450nm測定吸光度(OD)，計算細胞存活率[細胞存活率/%=(OD藥劑-OD空白對照)/(OD陰性對照-OD空白對照)×100%]。

2 結(jié)果與討論

2.1 Ⅰ的生物活性

(1)PPAR-γ的受體激動活性

PPAR-γ受體激動活性初步評價結(jié)果見表1。由表1可見，Ⅰ在用藥量為1.0×10-5mol·L-1時對PPAR-γ受體的激活作用與陽性對照吡格列酮相當(dāng)。

Ⅰ 的耐糖和耐胰島素實驗結(jié)果分別見表2和表3。由表2可見，Ⅰ對糖負荷的影響雖然與對照組比較無顯著性差異,但是其抑制血糖升高的傾向是顯而易見的。

由表3可見，在胰島素負荷的試驗中,2h時對照組的血糖值已經(jīng)回升,而Ⅰ與Pioglitazone還有明顯降血糖的作用,說明Ⅰ能明顯加強和延長外源性胰島素的降血糖作用。因此可以初步肯定,Ⅰ具有一定的降血糖活性,且可能具有提高組織對胰島素敏感性的作用。

表1 PPAR-γ受體激動活性Table1 In vitro PPAR-γ activities of PPAR-γ agonists

Ⅰ的細胞存活實驗結(jié)果見表4。由表4可見,Ⅰ在用藥量為(0.1～100)×10-6mol·L-1時未表現(xiàn)明顯的細胞毒作用。

Ⅰ的內(nèi)皮細胞保護作用實驗結(jié)果見表5。由表5可見，Ⅰ在高濃度(1.0×10-4mol·L-1)對H2O2所致細胞毒性有一定的保護作用。

表2 Ⅰ的耐糖實驗結(jié)果Table2 Oral glucose tolerance test in mice(x±SD,n=10)

表3 Ⅰ對小鼠胰島素負荷后血糖的影響(x±SD,n=10)Table3 Effect of Ⅰ on blood glucose under insulin load in mice(x±SD,n=10)

表4 Ⅰ的細胞存活實驗Table4 Cell viability assay of Ⅰ

表5 Ⅰ的內(nèi)皮細胞保護實驗(x±SD,n=10)Table5 Protective effect of human umbilical vein endothelial cells of Ⅰ(x±SD,n=10)

3 結(jié)論

合成了一個新的噻唑烷二酮類化合物——2-甲氧基-5-[(2,4-二氧代-5-噻唑烷基)-甲基]-N-[(3,5,6-三甲基-2-吡嗪基)-甲基]-苯甲酰胺(Ⅰ)。PPAR-γ的受體激動活性初步評價結(jié)果表明，Ⅰ 在用藥量1.0×10-5mol·L-1時對PPAR-γ受體的激活作用與陽性對照吡格列酮相當(dāng)。葡糖糖耐量實驗結(jié)果表明：Ⅰ有明顯抑制血糖升高的傾向和能明顯加強和延長外源性胰島素的降血糖作用。細胞存活實驗結(jié)果表明：Ⅰ在(0.1～100)×10-6mol·L-1內(nèi)未表現(xiàn)明顯的細胞毒作用；內(nèi)皮細胞保護作用實驗表明：Ⅰ在高濃度(1.0×10-4mol·L-1)時對H2O2所致細胞毒性有一定保護作用。

Ⅰ兼有降血糖作用和內(nèi)皮細胞保護作用，在一定程度上可以克服傳統(tǒng)PPAR-γ激動劑在心血管方面的副作用，對于Ⅱ型糖尿病的治療具有潛在應(yīng)用價值。

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SynthesisandBiologicalEvaluationofaNovelInsulinSensitizerwithNaturalScaffolds

SONG Yun-long1,2, HE Xin-hua1, FAN Shi-yong1, SHI Wei-guo1, JIA Hong-xin1, ZHONG Bo-hua1

(1.Institute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Medical Science of PLA，Beijing 100850，China;2.Department of Pharmacy,the Second Artillery General Hospital of PLA,Beijing 100088,China)

A novel insulin sensitizer,5-[(2,4-dioxothiazolidin-5-yl)methyl]-2-methoxy-N-[(3,5,6-trimethyl-pyrazin-2-yl)methyl]benzamide(Ⅰ),was designed and synthesized by combining the fragment of tetramethylpyrazine with pharmacophore of TZDs.The structure was characterized by1H NMR and MS.Ⅰ showed approximately equal PPAR-γagonist activity to Pioglitazone at 1.0×10-5mol·L-1invitro.Ⅰ could protect the vascular endothelial cells and it can be expected that the cardiovascular side effects may be reduced.

TZDs;insulin sensitizer;agonists;synthesis；biological evaluation

2014-04-14

國家新藥創(chuàng)制重大專項基金資助項目(2012ZX09301003-001-004)

宋云龍(1984-)，男，漢族，山東日照人，博士研究生，主管藥師，主要從事藥物合成的研究。Tel.010-66343013，E-mail: songyunlong12@163.com

仲伯華，研究員，Tel.010-66931693，E-mail: bohuazhong@yahoo.com

O626；O621.3

A

1005-1511(2014)05-0596-05