黃芪桂枝五物湯中總黃酮對小鼠免疫功能影響的體外研究※

李樹義 趙志強(qiáng) 張慶波 邊洪榮 賈麗霞

(河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063000)

黃芪桂枝五物湯中總黃酮對小鼠免疫功能影響的體外研究※

李樹義 趙志強(qiáng) 張慶波△邊洪榮1賈麗霞

(河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063000)

目的探討黃芪桂枝五物湯中總黃酮對小鼠免疫功能的影響，從而為臨床應(yīng)用提供參考。方法取小鼠脾淋巴細(xì)胞，加入不同濃度的總黃酮，采用水溶性四唑鹽(WST-1)法測定細(xì)胞的增殖活性；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-2(IL-2)和干擾素γ(IFN-γ)含量；流式細(xì)胞儀檢測小鼠脾細(xì)胞中CD3+、CD19+細(xì)胞。結(jié)果各濃度總黃酮組淋巴細(xì)胞增殖活性、IL-2、IFN-γ及CD3+細(xì)胞顯著高于對照組(P<0.05，P<0.01))。結(jié)論總黃酮可增強(qiáng)免疫功能，但只能提高細(xì)胞免疫功能，對體液免疫功能無明顯影響。

黃芪桂枝五物湯；免疫；干擾素Ⅱ型；白細(xì)胞介素2；動物實(shí)驗(yàn)

黃芪桂枝五物湯載于《金匱要略·血痹虛勞病脈證治》，由黃芪、芍藥、桂枝、生姜、大棗5味藥組成，具益氣溫經(jīng)、和營通脈之功[1]。原方主要是治療血痹，而現(xiàn)代臨床應(yīng)用已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越了原方“血痹”的范疇，尤其是在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、微循環(huán)障礙和中風(fēng)后遺癥等方面，收到滿意的療效[2]。長期以來備受中醫(yī)學(xué)者青睞，是臨床常用經(jīng)典

名方之一。

總黃酮是黃芪桂枝五物湯中的主要成分之一，具有多種重要的生物學(xué)作用，包括對免疫功能的影響，但總黃酮對機(jī)體免疫功能影響的系統(tǒng)研究，目前尚未見文獻(xiàn)報道。本研究通過小鼠脾細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)，探討總黃酮對免疫功能的影響，為臨床應(yīng)用和相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器 總黃酮：由河北聯(lián)合大學(xué)藥學(xué)院提供，提取方法參照文獻(xiàn)[3]。測增殖活性用試劑水溶性四唑鹽(WST)-1：購于江蘇碧云天生物科技公司。白細(xì)胞介素-2(IL-2)和干擾素γ(IFN-γ)檢測試劑盒：購于武漢博士德生物工程有限公司。全自動酶標(biāo)儀SpectraPlus384：美國Molecular Devices公司生產(chǎn)。流式細(xì)胞儀：EPICS?ALTRATM型，美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 取4～6周齡昆明種小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄各半，SPF級，購于北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，動物合格證號：0123883。

1.3 小鼠脾細(xì)胞增殖活性測定 取5周齡小鼠4只，雌雄各2只，頸椎脫臼處死，無菌分別取脾臟，細(xì)胞篩研磨成脾淋巴細(xì)胞懸液，加入1 mL蒸餾水破碎紅細(xì)胞，30 s后加入1.8% 氯化鈉溶液1 mL，離心去上清液，磷酸緩沖液(PBS)洗細(xì)胞3次，計(jì)細(xì)胞總數(shù)，調(diào)細(xì)胞濃度為1.0×106/mL。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加100 μL 細(xì)胞懸液，10 μL 不同濃度的總黃酮溶液(0.062 5、0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL)作為實(shí)驗(yàn)組，同時設(shè)不加總黃酮的對照組。每組設(shè)3個復(fù)孔，置二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)3、6、9 d，用WST-1測光密度(OD)值，4只小鼠取均值。

1.4 小鼠IL-2、IFN-γ測定 上述細(xì)胞測定增殖前，取上清50 μL置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。樣品收集完畢后，采用酶?lián)合免疫吸附法(ELISA)分別檢測IFN-γ、IL-2的含量(按酶聯(lián)免疫試劑盒說明書要求操作)。

1.5 細(xì)胞亞群分析 檢測小鼠脾細(xì)胞中CD3+細(xì)胞和CD19+細(xì)胞。取小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，以 5×106/mL 的濃度接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔2.0 mL，實(shí)驗(yàn)組加入0.5 mg/mL的總黃酮溶液0.1 mL，對照組加入0.1 mL RPMI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)6 d后，取細(xì)胞懸液，1 500 r/min，離心5 min；PBS洗滌；加入異硫氰酸熒光素(FITC)進(jìn)行免疫標(biāo)記反應(yīng)(100 μL細(xì)胞懸液：100 μL抗體)，避光孵育30 min；PBS 洗2次，每管加入200 μL 1%多聚甲醛固定，流式細(xì)胞儀檢測。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取最佳結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠脾細(xì)胞增殖活性比較 見表1。

表1 各組小鼠脾細(xì)胞增殖活性比較 OD值，±s

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

由表1可見，總黃酮組各濃度OD值均高于對照組，均對小鼠脾淋巴細(xì)胞有刺激增殖作用(P<0.05，P<0.01)。

2.2 各組小鼠IFN-γ比較 見表2。

由表2可見，總黃酮組各濃度IFN-γ值均高于對照組(P<0.05，P<0.01)。

組 別濃度(mg/mL)3d6d9d對照組-3．78±0．245．42±1．248．54±1．36總黃酮組0．06255．45±1．41?8．71±1．65?15．65±3．41?0．1256．81±1．12??10．36±1．77??19．52±3．75??0．2507．85±1．47??12．54±2．78??21．54±3．54??0．5009．56±1．63??16．56±2．44??28．63±3．46??1．0009．48±1．77??16．53±2．55??28．57±4．31??

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.3 各組小鼠IL-2比較 見表3。

由表3可見，總黃酮組各濃度IL-2值均高于對照組(P<0.05，P<0.01)。

組 別濃度(mg/mL)3d6d9d對照組-3．65±0．217．34±1．3210．17±3．47總黃酮組0．06256．56±0．54?10．24±3．42??17．42±5．47??0．1258．59±2．33?12．52±3．14??20．47±5．24??0．2509．45±2．32??16．27±3．54??21．57±5．17??0．50011．44±3．12??19．64±5．41??32．27±6．61??1．00011．34±2．34??19．51±3．61??32．13±5．41??

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.4 各組CD3+細(xì)胞比較 見表4。

表4 各組CD3+細(xì)胞比較

與對照組比較，*P<0.01

由表4可見，總黃酮組CD3+細(xì)胞數(shù)高于對照組(P<0.01)。

2.5 各組CD19+細(xì)胞比較 見表5。

表4 各組CD19+細(xì)胞比較

由表5可見，總黃酮組CD19+細(xì)胞數(shù)與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

目前，黃芪桂枝五物湯廣泛應(yīng)用于臨床治療各種疾病，能有效促進(jìn)機(jī)體免疫功能，改善機(jī)體健康狀況。關(guān)于黃芪桂枝五物湯臨床應(yīng)用的研究較多，已有文獻(xiàn)報道該方具有多種作用，如可改善糖尿病周圍神經(jīng)病變微循環(huán)障礙[4]，一定程度的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化作用[5-6]，對小鼠具有免疫調(diào)節(jié)作用[7]，并且有研究表明該方有抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α升高的作用[8]。但該方有效成分對機(jī)體免疫功能的影響在國內(nèi)外未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。

機(jī)體的免疫功能是在淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和其他有關(guān)細(xì)胞及其產(chǎn)物的相互作用下完成的，是免疫系統(tǒng)根據(jù)免疫識別而發(fā)揮作用。IL-2是T細(xì)胞生長因子，能刺激T細(xì)胞增殖，增強(qiáng)T細(xì)胞的殺傷活性，由IL-2誘導(dǎo)產(chǎn)生的T細(xì)胞輸入體內(nèi)后可產(chǎn)生明顯抗腫瘤作用[9]。干擾素(IFN)-γ增加能增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)作用，誘導(dǎo)多種抗原提呈細(xì)胞表達(dá)主要組織相容性抗原(MHC)-Ⅰ或Ⅱ分子，活化單核、巨噬細(xì)胞，并增強(qiáng)溶菌活性及分泌IL-1、6、8，TNF-α等。CD3分子是T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志物，CD19分子是B淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志物，可以看作CD3+細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞、CD19+細(xì)胞是B淋巴細(xì)胞[10]。

我們采用黃兆勝等[11]對黃芪桂枝五物湯及其配伍抗炎鎮(zhèn)痛的比較研究，將該方按藥對研究法拆方分組，通過小鼠脾細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)，探討總黃酮對免疫功能的影響。本實(shí)驗(yàn)用黃芪桂枝五物湯中總黃酮分別對外周免疫器官(脾)、免疫細(xì)胞(CD3+、CD19+)及細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ)分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比較，黃芪桂枝五物湯中的總黃酮能刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)IL-2和IFN-γ的分泌，且在一定濃度范圍內(nèi)，隨著總黃酮濃度的增加，細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的分泌效果也隨之增加，具有明顯的量效關(guān)系，但當(dāng)總黃酮濃度>0.500 mg/mL時，其增殖及分泌效果的量效關(guān)系不明顯，可能是藥物濃度過高對免疫細(xì)胞的毒性增強(qiáng)，導(dǎo)致其增殖不明顯，分泌效果差。本研究證明總黃酮可能具有增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫功能的作用。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，黃芪桂枝五物湯中的總黃酮對CD3+細(xì)胞作用明顯強(qiáng)于CD19+細(xì)胞，即對T細(xì)胞有促進(jìn)增殖作用，但對B細(xì)胞作用不明顯，進(jìn)一步證明總黃酮能增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫，但可能對體液免疫作用不明顯。

黃芪桂枝五物湯各藥物協(xié)同作用后獲得的總黃酮對機(jī)體適應(yīng)性免疫功能影響增強(qiáng)，主要是細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)。細(xì)胞免疫的主要作用是抗病毒感染和抗腫瘤，可以指導(dǎo)臨床應(yīng)用黃芪桂枝五物湯治療病毒感染及腫瘤，同時我們的研究結(jié)果可為其他研究者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)提供重要的參考依據(jù)。

[1] 黃仰模.金匱要略講義[J].北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：71-72.

[2] 趙蕊.黃芪桂枝五物湯的臨床應(yīng)用[J].黑龍江中醫(yī)藥，2007，36(4)：60-62.

[3] 邊洪榮，婁桂芹，張慶波，等.均勻設(shè)計(jì)黃芪桂枝五物湯不同劑量配比總黃酮含量的比較研究[J].中藥材，2010，33(2)：279-281.

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(本文編輯：曹志娟)

·信息·

嚴(yán)禁擅自組織幼兒及學(xué)生群體服藥

3月18日從教育部官方網(wǎng)站獲悉，針對陜西、吉林兩地個別幼兒園違規(guī)開展群體性服藥事件，教育部、國家衛(wèi)生計(jì)生委于3月17日聯(lián)合發(fā)出通報強(qiáng)調(diào)，任何單位或個人不得擅自或越權(quán)組織幼兒及中小學(xué)生群體服藥。因常見疾病防治需要而組織幼兒及中小學(xué)生群體服藥時，要做到“五個必須”。

通報指出，個別幼兒園違規(guī)開展群體性服藥的行為嚴(yán)重違反了《教育部辦公廳、衛(wèi)生部辦公廳關(guān)于加強(qiáng)和規(guī)范學(xué)生健康服務(wù)工作管理的通知》要求，造成嚴(yán)重的社會影響，有關(guān)部門正在依法依規(guī)進(jìn)行查處。

通報要求，各地教育、衛(wèi)生計(jì)生行政部門及幼兒園、中小學(xué)校必須按照有關(guān)文件規(guī)定，嚴(yán)格管理幼兒及學(xué)生健康服務(wù)工作。因常見疾病防治需要而組織幼兒及中小學(xué)生群體服藥時，必須事先經(jīng)醫(yī)療衛(wèi)生專家論證，必須經(jīng)縣級以上衛(wèi)生計(jì)生行政部門商同級教育行政部門同意，并制訂詳細(xì)的防治方案，必須堅(jiān)持學(xué)生和家長知情同意、自愿參加的原則，必須有衛(wèi)生技術(shù)人員進(jìn)行現(xiàn)場指導(dǎo)，必須向證照俱全的正規(guī)醫(yī)藥生產(chǎn)、經(jīng)營企業(yè)購買藥品。任何單位或個人不得擅自或越權(quán)組織幼兒及中小學(xué)生群體服藥。

EffectoftotalflavonesinHuangqiGuizhiWuwudecoctionofmiceonimmunefunctioninvitro

LIShuyi，ZHAOZhiqiang，ZHANGQingbo，etal.

BasicMedicalCollegeofHebeiUnitedUniversity，Hebei，Tangshan063000

ObjectiveTo research the effect of total flavones extracted from Huangqi guizhi wuwu decoction on immune function mice on in vitro，and to provide a reference for the clinical application.MethodsSplenic lymphocyte of mice were extracted，and stimulated with different concentration flavones.Proliferations of the cells were detected with WST-1 assay；IL-2，IFN-γ secreted by the cells were examined with enzyme linked immune sorbent assay (ELISA)；Cell subtypes were checked with flow cytometry (FCM).ResultsCompared with the control group，proliferation of the cells and concentration of IL-2，IFN-γ and CD3+in different concentration total flavones group increased significantly (P<0.05，P<0.01).ConclusionThe total flavones might enhance cellular immune function but not humoral immune function.

Huangqi Guizhi Wuwu decoction；Immune；IFN-γ；IL-2；Animal experiment

※ 項(xiàng)目來源：2013年唐山市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃增補(bǔ)項(xiàng)目(編號：13130253z)

△ 通訊作者：河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063000

1 河北聯(lián)合大學(xué)藥學(xué)院，河北 唐山 063000

李樹義(1974—)，副主任檢驗(yàn)師，主治醫(yī)師，碩士研究生在讀。研究方向：中藥有效成分對機(jī)體免疫功能的影響。

R289.5；R285.5；R392-33

A

1002-2619(2014)03-0432-03

2013-10-25)