阿莫西林對(duì)副豬嗜血桿菌和豬胸膜肺炎放線桿菌的藥敏試驗(yàn)

曹傳家+王春梅

摘要：以大腸桿菌ATCC25922為質(zhì)控菌株，采用阿莫西林對(duì)5株豬胸膜肺炎放線桿菌和6株副豬嗜血桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，測(cè)定其最小抑菌濃度（MIC）。結(jié)果表明，胸膜肺炎放線桿菌和副豬嗜血桿菌對(duì)阿莫西林敏感。

關(guān)鍵詞：阿莫西林；豬胸膜肺炎放線桿菌；副豬嗜血桿菌；藥敏試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S852.61+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2014）06-0009-02

副豬嗜血桿菌（Hps）在環(huán)境中普遍存在，世界各地都有，甚至是健康的豬群當(dāng)中也能發(fā)現(xiàn)。臨床上以體溫升高、關(guān)節(jié)腫脹、呼吸困難、多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和高死亡率為特征的傳染病，嚴(yán)重危害仔豬和青年豬的健康。豬胸膜肺炎放線桿菌（APP）可以感染從斷奶到屠宰的各日齡的豬，但通常發(fā)生在8～16周齡，潛伏期短，可能只有12 h。病菌產(chǎn)生的毒素會(huì)導(dǎo)致肺部嚴(yán)重?fù)p傷[1]。豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌引起的豬的一種高度致死性呼吸道傳染病。從20世紀(jì)90 年代開始，隨著集約化養(yǎng)豬業(yè)的迅速發(fā)展，加上國(guó)家及地區(qū)間引種工作的日益頻繁，豬傳染性胸膜肺炎在我國(guó)已廣泛流行，并有擴(kuò)大蔓延之勢(shì)[2，3]。為對(duì)防治這兩種細(xì)菌引起的疾病提供更好的用藥方案，特對(duì)Hps和APP進(jìn)行阿莫西林的藥敏試驗(yàn)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，APP和Hps對(duì)青霉素、卡那霉素、氯霉素、先鋒霉素、強(qiáng)力霉素、阿莫西林、復(fù)方新諾明、沙星類藥物、多粘菌素、利福平、喹諾酮和頭孢噻呋類藥物敏感。對(duì)于有APP和Hps潛在感染可能的豬場(chǎng)，平時(shí)在飼料中可以添加適量抗生素進(jìn)行預(yù)防。一旦發(fā)現(xiàn)有APP和Hps感染，豬場(chǎng)應(yīng)及時(shí)選用氯霉素、青霄素、新霉素、卡那霉素、增效磺胺類、呋喃類藥物對(duì)感染動(dòng)物進(jìn)行治療。長(zhǎng)期使用同種抗生素易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，并且APP和Hps耐藥性現(xiàn)象已經(jīng)廣泛存在。因此，為了獲得良好的預(yù)防治療效果，并盡量避免耐藥性產(chǎn)生，就需要進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，篩選出低耐藥性的藥物。阿莫西林抗菌譜廣，殺菌力強(qiáng)，在臨床上用于治療敏感細(xì)菌所致的各種感染，對(duì)于豬巴氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、嗜血桿菌、鏈球菌、葡萄球菌性呼吸道感染均有較好的效果[4]。為了更好的防治Hps和APP引起的疾病，本研究選擇阿莫西林對(duì)這兩種細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和試劑 阿莫西林對(duì)照品（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，K0220705），磷酸氫二鉀（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，F(xiàn)20070423），磷酸二氫鉀（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，F(xiàn)20070215），MH肉湯、TSA和TSB均由青島海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 主要儀器及設(shè)備 電子天平（湘儀天平儀器設(shè)備有限公司，TP320），分析天平（SHIMADZU），隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司），超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司），手提式壓力蒸汽滅菌鍋（上海醫(yī)用核子儀器廠）。

1.1.3 試驗(yàn)菌株 大腸桿菌ATCC25922；App標(biāo)準(zhǔn)菌株7型（B7），3型（B3），1型（B1），地方分離菌株3型（D3），1型（D1）；Hps國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株S13，S5，S4，地方分離菌株13型（D13），5型（D5），4型（D4）。上述菌種均來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

pH 6.0磷酸鹽緩沖液：精密稱取KH2PO4 8.0 g和K2HPO4 2.0 g，加蒸餾水溶解并稀釋成1 000 mL，分裝，121℃滅菌30 min備用。

阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：將阿莫西林對(duì)照品置于37 ℃干燥箱干燥48 h后，精確稱量14.78 mg于10 mL容量瓶中，用無菌pH 6.0磷酸鹽緩沖液溶解并定容，得1 280 μg/mL阿莫西林儲(chǔ)備液。-20 ℃保存。

1.2.2 培養(yǎng)基制備

胰酶大豆肉湯培養(yǎng)基：含TSB，30 g/L，121 ℃滅菌15 min，臨用前加NAD（氧化型輔酶I）10 μg/mL和10%的無肺炎支原體犢牛血清。

胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)基：含TSA 40 g/L，121 ℃滅菌15 min，待溫度降至50 ℃時(shí)，加入NAD 10 μg/mL和10%的無肺炎支原體犢牛血清。

MH肉湯培養(yǎng)基：21 g/L，115 ℃滅菌15min，校正pH7.4±0.2，121 ℃滅菌15 min，備用，臨用前加NAD 10 μg/mL和10%的無肺炎支原體犢牛血清。

1.2.3 菌種復(fù)蘇 將凍干菌種接種于含NAD與不含NAD的TSA平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h。菌種在未含有NAD 的培養(yǎng)平板上不生長(zhǎng)，而在含NAD的平板上生長(zhǎng)。挑取在含NAD的培養(yǎng)平板上生長(zhǎng)的單個(gè)菌落于NAD/TSA平板上進(jìn)行純培養(yǎng)，連續(xù)傳代2次。

1.2.4 菌株接種 從TSA平板上選取傳代3次之后的3～5個(gè)菌落，用接種環(huán)接觸每個(gè)菌落頂部后將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到5mLTSB中。將此肉湯培養(yǎng)物置37℃孵育8h，用加有NAD和無肺炎支原體新生牛血清的MH肉湯將菌液稀釋至相當(dāng)于5號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁艿臐岫龋舛葹?.5×108CFU/mL），將稀釋后的菌液再稀釋100倍備用。

1.2.5 最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定 用微量稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度。將1 280μg/mL的藥液用MH肉湯稀釋至16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.031 25 μg/mL，微孔板以排為單位分為1、2、3、4、5、6、7、8組：每種菌做3個(gè)平行樣。藥液以從高到底的濃度加入到每行的第一孔至第十一孔中，每孔50 μL，再向第一孔至第十孔中各加入稀釋好的菌液50 μL，第十一孔作為陰性對(duì)照孔，只加100 μL藥液不加菌液，第十二孔作為陽(yáng)性對(duì)照孔，只加100 μL菌液不加藥物。放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2 結(jié)果與分析

培養(yǎng)24 h后，觀察各孔細(xì)菌生長(zhǎng)情況，與對(duì)照孔比較，以目測(cè)法找出始變澄清的第一孔，該管中所含藥物濃度，即為MIC。

3 討論

3.1 細(xì)菌的保存

由于App和Hps比較脆弱，在加入小牛血清和NAD的TSA培養(yǎng)基中4 ℃可存活7 d，在85%的甘油生理鹽水中，-20 ℃下可存活3個(gè)月，存活時(shí)間均不夠理想，所以在保這兩種菌種時(shí)，筆者采用脫脂牛奶加TSB作為保護(hù)劑，對(duì)菌株進(jìn)行真空冷凍干燥，并于-80 ℃中冰箱中保存，此方法保存的菌株，兩年后仍能很好的進(jìn)行復(fù)蘇。

3.2 藥物敏感性

由試驗(yàn)結(jié)果可知，所選的App和Hps對(duì)阿莫西林敏感，可以作為這兩種細(xì)菌所引起疾病的治療藥物。由于本藥敏試驗(yàn)使用的菌株比較少，無法進(jìn)行MIC50和MIC90的計(jì)算，但有文獻(xiàn)報(bào)道，在臨床分離的App的藥敏試驗(yàn)中，阿莫西林對(duì)App的MIC90分別為0.5 μg/mL[6]。要對(duì)感染App的豬進(jìn)行有效治療，阿莫西林在感染部位（肺部）的濃度需要達(dá)到

1 μg/mL。藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)表明，阿莫西林在給藥后，血漿中的藥物濃度通常為肺部的3倍，如果采用美國(guó)輝瑞公司生產(chǎn)的一種長(zhǎng)效阿莫西林混懸注射液以15 mg/kg的劑量進(jìn)行肌注給藥，可以在App的感染部位達(dá)到足夠的藥物濃度。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳 品.副豬嗜血桿菌耐藥性分子機(jī)制研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[2] 陳小玲，楊旭夫，朱士盛.豬傳染性胸膜肺炎的流行現(xiàn)狀和防制措施[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2001，7（37）：33-35.

[3] 高 林，宋良敏，金石等.豬傳染性胸膜肺炎的診斷與防制[J].養(yǎng)豬，1999（1）：37-39.

[4] 張玲玲，江善祥.阿莫西林藥理與毒理研究進(jìn)展[J].獸藥與飼料添加劑，2009，14（1）：20-23.

[5] 方泉明，黃建珍，黃冬艷.副豬嗜血桿菌江西株的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2009，36（4）：163-164.

[6] 曾振靈，丁煥中，楊志凌等.阿莫西林鈉在豬體內(nèi)的生物利用度及藥動(dòng)學(xué)研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，33（6）：594-597.

2 結(jié)果與分析

培養(yǎng)24 h后，觀察各孔細(xì)菌生長(zhǎng)情況，與對(duì)照孔比較，以目測(cè)法找出始變澄清的第一孔，該管中所含藥物濃度，即為MIC。

3 討論

3.1 細(xì)菌的保存

由于App和Hps比較脆弱，在加入小牛血清和NAD的TSA培養(yǎng)基中4 ℃可存活7 d，在85%的甘油生理鹽水中，-20 ℃下可存活3個(gè)月，存活時(shí)間均不夠理想，所以在保這兩種菌種時(shí)，筆者采用脫脂牛奶加TSB作為保護(hù)劑，對(duì)菌株進(jìn)行真空冷凍干燥，并于-80 ℃中冰箱中保存，此方法保存的菌株，兩年后仍能很好的進(jìn)行復(fù)蘇。

3.2 藥物敏感性

由試驗(yàn)結(jié)果可知，所選的App和Hps對(duì)阿莫西林敏感，可以作為這兩種細(xì)菌所引起疾病的治療藥物。由于本藥敏試驗(yàn)使用的菌株比較少，無法進(jìn)行MIC50和MIC90的計(jì)算，但有文獻(xiàn)報(bào)道，在臨床分離的App的藥敏試驗(yàn)中，阿莫西林對(duì)App的MIC90分別為0.5 μg/mL[6]。要對(duì)感染App的豬進(jìn)行有效治療，阿莫西林在感染部位（肺部）的濃度需要達(dá)到

1 μg/mL。藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)表明，阿莫西林在給藥后，血漿中的藥物濃度通常為肺部的3倍，如果采用美國(guó)輝瑞公司生產(chǎn)的一種長(zhǎng)效阿莫西林混懸注射液以15 mg/kg的劑量進(jìn)行肌注給藥，可以在App的感染部位達(dá)到足夠的藥物濃度。

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[5] 方泉明，黃建珍，黃冬艷.副豬嗜血桿菌江西株的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2009，36（4）：163-164.

[6] 曾振靈，丁煥中，楊志凌等.阿莫西林鈉在豬體內(nèi)的生物利用度及藥動(dòng)學(xué)研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，33（6）：594-597.

2 結(jié)果與分析

培養(yǎng)24 h后，觀察各孔細(xì)菌生長(zhǎng)情況，與對(duì)照孔比較，以目測(cè)法找出始變澄清的第一孔，該管中所含藥物濃度，即為MIC。

3 討論

3.1 細(xì)菌的保存

由于App和Hps比較脆弱，在加入小牛血清和NAD的TSA培養(yǎng)基中4 ℃可存活7 d，在85%的甘油生理鹽水中，-20 ℃下可存活3個(gè)月，存活時(shí)間均不夠理想，所以在保這兩種菌種時(shí)，筆者采用脫脂牛奶加TSB作為保護(hù)劑，對(duì)菌株進(jìn)行真空冷凍干燥，并于-80 ℃中冰箱中保存，此方法保存的菌株，兩年后仍能很好的進(jìn)行復(fù)蘇。

3.2 藥物敏感性

由試驗(yàn)結(jié)果可知，所選的App和Hps對(duì)阿莫西林敏感，可以作為這兩種細(xì)菌所引起疾病的治療藥物。由于本藥敏試驗(yàn)使用的菌株比較少，無法進(jìn)行MIC50和MIC90的計(jì)算，但有文獻(xiàn)報(bào)道，在臨床分離的App的藥敏試驗(yàn)中，阿莫西林對(duì)App的MIC90分別為0.5 μg/mL[6]。要對(duì)感染App的豬進(jìn)行有效治療，阿莫西林在感染部位（肺部）的濃度需要達(dá)到

1 μg/mL。藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)表明，阿莫西林在給藥后，血漿中的藥物濃度通常為肺部的3倍，如果采用美國(guó)輝瑞公司生產(chǎn)的一種長(zhǎng)效阿莫西林混懸注射液以15 mg/kg的劑量進(jìn)行肌注給藥，可以在App的感染部位達(dá)到足夠的藥物濃度。

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[4] 張玲玲，江善祥.阿莫西林藥理與毒理研究進(jìn)展[J].獸藥與飼料添加劑，2009，14（1）：20-23.

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[6] 曾振靈，丁煥中，楊志凌等.阿莫西林鈉在豬體內(nèi)的生物利用度及藥動(dòng)學(xué)研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，33（6）：594-597.