正交試驗(yàn)優(yōu)選復(fù)方連芩凝膠提取工藝*

★ 胡鳳鳴 丁志軍 羅美蘭 廖銀根

(江西省皮膚病專(zhuān)科醫(yī)院 江西 南昌 330001)

復(fù)方連芩凝膠系江西省皮膚病專(zhuān)科醫(yī)院中醫(yī)科專(zhuān)家多年臨床總結(jié)經(jīng)驗(yàn)方，由黃連、黃芩、苦參、黃柏、地膚子、紫草和蛇床子等7味中藥組成，具有瀉火解毒、除濕的功效，臨床上主要用于治療濕疹、皮炎等風(fēng)熱、濕熱之皮膚病。為了將復(fù)方連芩煎劑更好地應(yīng)用于臨床，我院研究開(kāi)發(fā)出攜帶和使用均方便的復(fù)方連芩凝膠劑，并對(duì)其制備工藝進(jìn)行了研究。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 高效液相色譜(HPLC)系統(tǒng)(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；CP225D微量天平(德國(guó)Sartorius 公司)；KQ-500E醫(yī)用超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

鹽酸小檗堿、黃芩苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為110713-201212、110715-201117)；黃連、黃芩、黃柏飲片(安徽致和堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為120618，111209，120107)；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 評(píng)價(jià)指標(biāo)的確定 復(fù)方連芩凝膠處方中有多味藥材，有效成分眾多，根據(jù)文獻(xiàn)和藥材實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取君藥黃連、臣藥黃柏的有效成分鹽酸小檗堿及另一臣藥黃芩中有效成分黃芩苷含量作為優(yōu)選工藝的考察指標(biāo)，符合配方及工藝的特點(diǎn)。

2.2 鹽酸小檗堿和黃芩苷的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動(dòng)相A、0.05 mol/L磷酸二氫鉀為流動(dòng)相B，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm，流速為1.0 mL/min；柱溫為20 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。

時(shí)間/min流動(dòng)相A/%流動(dòng)相/B0-920809-403367

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取鹽酸小檗堿、黃芩苷對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解，制成每1 mL分別含50 μg、60 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取提取濃縮液1 mL，置具塞錐形瓶中，精密加入75%乙醇50 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理(功率：250 W，頻率：33 kHz)30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用75%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例，稱(chēng)取本處方中除黃連、黃芩、黃柏外的各味藥材，分別加10倍水，煎煮兩次，每次1 h，減壓濃縮，定容至1000 mL，按上述供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各5 μL，注入液相色譜儀測(cè)定其峰面積，計(jì)算鹽酸小檗堿、黃芩苷含量。液相色譜圖見(jiàn)圖1。

A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照品

2.3 藥材飲片中有效成分的含量測(cè)定

2.3.1 黃連藥材飲片中鹽酸小檗堿的含量測(cè)定[1]稱(chēng)取黃連飲片粉末(過(guò)二號(hào)篩)約0.2 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸(100∶1)的混合溶液50 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理30min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。按中國(guó)藥典2010年版一部黃連含量測(cè)定項(xiàng)下方法進(jìn)樣，測(cè)得黃連飲片中鹽酸小檗堿含量為6.12%。

2.3.2 黃柏藥材飲片中鹽酸小檗堿的含量測(cè)定[1]取本品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.1 g，精密稱(chēng)定，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相80 mL，超聲處理40min，放冷，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。按中國(guó)藥典2010年版一部黃柏含量測(cè)定項(xiàng)下方法進(jìn)樣，測(cè)得黃柏飲片中鹽酸小檗堿含量為4.36%。

2.3.3 黃芩藥材飲片中黃芩苷的含量測(cè)定[1]取本品中粉約0.3 g，精密稱(chēng)定，加70%乙醇40 mL，加熱回流3h，放冷，濾過(guò)，濾液置100 mL量瓶中，用少量70%乙醇分次洗滌容器和殘?jiān)?，洗液濾入同一量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻。精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。按中國(guó)藥典2010年版一部黃芩含量測(cè)定項(xiàng)下方法進(jìn)樣，測(cè)得黃芩飲片中黃芩苷含量為9.86%。

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝

2.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過(guò)預(yù)試驗(yàn)對(duì)影響水煎煮的各因素進(jìn)行考察，選擇加水量(A)、提取時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)為影響水煎煮的主要因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平。因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平表

2.4.2 正交試驗(yàn)安排及結(jié)果 按處方比例稱(chēng)取黃連、黃芩、黃柏等藥材72 g，共9份，根據(jù)L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表，將藥材浸泡0.5 h后提取。提取完畢后，將不同條件下的水提液分別濃縮至適量，定容至1000 mL，稱(chēng)定重量，備用。以鹽酸小檗堿、黃芩苷轉(zhuǎn)移率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2；方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

由表2、表3可知，以鹽酸小檗堿為評(píng)價(jià)指標(biāo)，A因素有顯著性影響，各因素的影響順序?yàn)锳>C>B，以A3B1C2最佳；以黃芩苷轉(zhuǎn)移率為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，A因素有顯著性影響，各因素影響順序?yàn)锳>C>B，以A2B1C3最佳?？紤]到節(jié)約能源，降低成本，從而得到最佳工藝為A2B1C2，即加10倍量水，提取2次，每次1 h。

2.5 工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，以確保提取工藝合理可行，按上述工藝條件A2B1C2，重復(fù)安排3批試驗(yàn)。結(jié)果，鹽酸小檗堿、黃芩苷平均轉(zhuǎn)移率分別為69.5%、71.2%，與正交試驗(yàn)較好的結(jié)果相近，表明優(yōu)選的工藝合理、可行。

3 討論

在測(cè)定指標(biāo)成分含量時(shí)，以HPLC同時(shí)測(cè)定復(fù)方連芩凝膠提取液中鹽酸小檗堿、黃芩苷含量，對(duì)其方法學(xué)進(jìn)行了考察，分離效果理想，重現(xiàn)性好，考慮到本文主要報(bào)道提取工藝研究，故暫未將其列入正文。

采用正交設(shè)計(jì)，并根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，確定了水提工藝的最佳條件，即稱(chēng)取水提取部分藥材，加入藥材量10倍體積的水，加熱提取2次，每次1 h，其中第1次提取前先將藥材浸泡0.5 h。

由于黃芩藥材中含有多種酶，主要是黃芩酶，在一定的溫度、濕度條件下，能使苷水解，黃芩酶遇冷水后活性增大，因此，黃芩應(yīng)在水沸后加入。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典.一部[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:282、285、286.