高效毛細(xì)管電泳內(nèi)標(biāo)法測定山銀花中綠原酸含量*

★ 徐東升 高言明 楊春 林昌虎 吳明花 唐才林

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院 貴州 貴陽 550002；2. 貴州理工學(xué)院 貴州 貴陽 550003；3.貴州科學(xué)院 貴州 貴陽 550001)

高效毛細(xì)管電泳在分析藥物成分時(shí)具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但由于采用壓力進(jìn)樣，樣品的小瓶蓋氣密性不好而導(dǎo)致進(jìn)樣體積精密度差，最終含量測定結(jié)果不準(zhǔn)確，若采用內(nèi)標(biāo)法可消除這一缺陷。而內(nèi)標(biāo)物的確定往往比較困難，經(jīng)過多次試驗(yàn)，最終選擇了腺苷作為本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)標(biāo)物，并成功地對山銀花樣品中綠原酸進(jìn)行了準(zhǔn)確測定，為高效毛細(xì)管電泳的推廣使用和山銀花的質(zhì)量研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效毛細(xì)管電泳儀(美國安捷倫公司)，DAD檢測器，安捷倫化學(xué)工作站，自動進(jìn)樣器； AE-240雙量程電子分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司)；Dela320型pH計(jì)(梅特勒-托利多上海有限公司)；超聲清洗器(KQ5200DE型，昆山市超聲儀器有限公司)；熔融石英毛細(xì)管柱(河北永年銳灃色譜器件有限公司)。

1.2 試藥 綠原酸對照品(中國藥品生物制品鑒定所，批號：110753-200413)；腺苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110879-200202)；甲醇為色譜純；水為娃哈哈純凈水。藥材樣品分別于2012年4月底至5月初采自貴州省綏陽縣小關(guān)鄉(xiāng)的15個灰氈毛忍冬種植點(diǎn)和安龍縣德臥鎮(zhèn)、興義市則戎鄉(xiāng)的黃褐毛忍冬種植點(diǎn)，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院副教授魏升華鑒定為灰氈毛忍冬LoniceramacranthoidesHand-Mazz和黃褐毛忍冬LonicerafulvutumentosaHsu et S.C.Cheng的花蕾。樣品在室內(nèi)陰干經(jīng)粉碎后于45℃烘至恒重并置于干燥器中備用。

A.腺苷；B.綠原酸

A.腺苷；B.綠原酸

2 方法與結(jié)果

2.1 電泳條件[1]毛細(xì)管：75μm×96cm的熔融石英毛細(xì)管柱，有效長度為87.8cm；DAD檢測器，檢測波長為254nm；以20mmol/L的硼砂(pH=9.12)作為緩沖溶液；工作電壓30KV，壓力進(jìn)樣：20KPa,15S；緩沖溶液封口：10KPa，5S；柱溫20℃；每次進(jìn)樣前用緩沖溶液沖柱15min。分離結(jié)果見圖1和圖2。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品適量，加甲醇制成濃度為0.10mg/mL的綠原酸對照品溶液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱取腺苷適量，加甲醇制成濃度為0.10mg/mL的腺苷內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備[2]精密稱取山銀花樣品粉末約0.1g，置于具塞錐形瓶中，加入50%甲醇溶液40mL，超聲45min，取出，放冷，過濾，精密吸取濾液1mL于10mL量瓶中，再精密加入腺苷內(nèi)標(biāo)溶液1mL，用甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜慮過，即得供試品溶液。

2.3 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取濃度為0.10mg/mL的綠原酸對照品溶液0.3，0.8，1.3，1.8，2.3，2.8mL，置于6個10mL的容量瓶中，各精密加入“2.2.2”項(xiàng)下制備好的內(nèi)標(biāo)溶液1mL，用甲醇定容至刻度，搖勻，得一濃度梯度的混合對照品溶液，分別吸取上述濃度的混合對照品溶液0.45mL置于6個樣品小瓶中，用新的樣品小瓶蓋蓋緊，按“2.1”項(xiàng)下的“電泳條件”進(jìn)行電泳分離測定。以綠原酸和腺苷的峰面積之比為縱坐標(biāo)(Y)，以綠原酸濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸計(jì)算，得綠原酸的回歸方程為：Y=0.0771X-0.0299，r=0.9990。結(jié)果表明當(dāng)腺苷的濃度為0.01mg/mL時(shí)，綠原酸在3～28mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn) 在樣品小瓶中精密加入內(nèi)含0.01mg/mL的腺苷內(nèi)標(biāo)物，濃度為13μg/mL的綠原酸對照品溶液0.45 mL，用新的樣品小瓶蓋蓋緊，按“2.1項(xiàng)下電泳條件”重復(fù)測定6次，以測得綠原酸和腺苷的峰面積比值計(jì)算RSD為0.59%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取按“2.2.3”項(xiàng)下制備的供試品溶液，在0, 2, 4, 6, 8, 10, 12h分別按“2.1項(xiàng)下的電泳條件”進(jìn)行電泳分離測定，以綠原酸和腺苷的峰面積比值計(jì)算RSD為1.01%，表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取山銀花樣品粉末約0.1g，共6份，分別置于6個具塞錐形瓶中，按“2.2.3”項(xiàng)下“供試品溶液的制備”方法制備供試液，按“2.1”項(xiàng)下的“電泳條件”進(jìn)行電泳分離測定，得樣品中綠原酸平均含量為3.23%，RSD為1.57%。

2.7 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知綠原酸平均含量為3.23%的山銀花樣品粉末6份，每份約0.05g，分別置于具塞錐形瓶中，在每份樣品中加入用50%甲醇溶液配制的濃度為0.04mg/mL的綠原酸對照品40mL，按“2.2.3”項(xiàng)下“供試品溶液的制備”方法制備供試液，按“2.1”項(xiàng)下的“電泳條件”進(jìn)行電泳分離測定，計(jì)算出綠原酸的平均回收率為98.61%，RSD為2.78%，表明本法能夠準(zhǔn)確地測定中藥山銀花中綠原酸的含量。

2.8 含量測定 分別精密稱取各藥材樣品粉末約0.1g，按“2.2.3”項(xiàng)下“供試品溶液的制備”方法制備供試液，按“2.1”項(xiàng)下的“電泳條件”進(jìn)行電泳分離測定，結(jié)果見表1。

表1 黔產(chǎn)山銀花中綠原酸含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 雖然高效液相色譜法測定山銀花中綠原酸含量的方法已經(jīng)較為成熟[3,4],而只要內(nèi)標(biāo)物選定準(zhǔn)確，采用高效毛細(xì)管電泳法更具有準(zhǔn)確，省時(shí)，簡便和環(huán)保等的優(yōu)勢。

3.2 綠原酸的最大吸收波長為330nm，但在此波長下內(nèi)標(biāo)物腺苷卻沒有吸收。選擇254nm處綠原酸和腺苷均有較大響應(yīng)信號，且雜峰較少，測定結(jié)果較為理想，故本實(shí)驗(yàn)采用254nm作為檢測波長。

3.3 由測定結(jié)果可以看出，灰氈毛忍冬中的綠原酸均較黃褐毛忍冬高，如果僅用綠原酸含量高低來評價(jià)山銀花質(zhì)量，那么灰氈毛忍冬的質(zhì)量應(yīng)該優(yōu)于黃褐毛忍冬[5]。

[1]高言明，宋勤，陳惠玲，等.毛細(xì)管區(qū)帶電泳法測定人工種植粗毛淫羊藿中綠原酸的含量[J].藥物分析雜志, 2006,26(8)：1 088-1 090.

[2]張露，陳豆弟. 綠原酸提取工藝研究進(jìn)展[J].杭州化工，2012,43(4)：4-6.

[3]李錦粲 吳洪文.HPLC同時(shí)測定山銀花中綠原酸和木犀草苷的含量[J].北方藥學(xué)， 2013，10(8)：10-11.

[4]中國藥典委員會. 中國藥典·一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社, 2010：28.

[5]劉嵐, 李榮. 山銀花藥用成分的提取及抑菌活性研究[J].中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志, 2012，40(3)：298-299.