生物活性因子修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進(jìn)展

賈佳　胡繼宏

[摘要] 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是骨髓基質(zhì)中存在的非造血系的具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，現(xiàn)已成為國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。生物活性因子分布在人體各個(gè)組織中，對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有重要的調(diào)節(jié)作用。文章從BMSCs的含義、細(xì)胞特性、聯(lián)合多種生物活性因子及對(duì)組織的治療等方面進(jìn)行詳細(xì)的闡述。

[關(guān)鍵詞] 生物活性因子；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；基因修飾

[中圖分類號(hào)] R457.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）13-48-04

[Abstract] Bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） are non-hematopoietic adult stem cells existing in bone marrow matrix that have multi-directional differentiation potential and they have become the hotspot of domestic and overseas medical research.Bioactive factors distribute all over the tissues of human body and have important regulatory effect on the BMSCs.This paper illustrates the implication，cell characteristics，multiple bioactive factors combination，tissue treatment and other aspects in detail.

[Key words] Bioactive factor；Bone marrow mesenchymal stem cells；Gene modification

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是一類自我更新能力強(qiáng)、多向分化潛能、可塑性高的干細(xì)胞。在特殊的誘導(dǎo)下，能分化為多種細(xì)胞，包括心肌細(xì)胞、骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等等。目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的優(yōu)勢(shì)已發(fā)揮重大的作用，已有多種不同的生物活性因子被導(dǎo)入到BMSCs中，并持續(xù)在BMSCs中表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)和刺激BMSCs的增殖、分化及成熟。

1 BMSCs的來源及其分子表達(dá)

目前研究最多、最為深入的就是骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，它是構(gòu)成骨髓造血微環(huán)境的重要部分，具有支持和造血調(diào)控的作用。也有人稱其為骨髓基質(zhì)細(xì)胞，是因?yàn)樗鼈儊碜怨撬璧闹С纸Y(jié)構(gòu)，起到維持造血干細(xì)胞存活及其功能的作用。隨著對(duì)這種細(xì)胞研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)其在多向分化、自我更新、免疫調(diào)節(jié)、分泌細(xì)胞因子功能等方面具有獨(dú)特的性質(zhì)，故目前學(xué)術(shù)界一般將其稱BMSCs。

一般認(rèn)為，BMSCs能表達(dá)CD34、CD106、CD124、CD105、CD146、CD90、CD13、CD44、CD54、CD29、CD73、CD120a、CD166、SH2、SH3、SH4、STRO-1特異性細(xì)胞表面抗原以及ALCAM/CD44黏附分子，但一般不表達(dá)類似造血干細(xì)胞表面的相關(guān)分子[1]。

2 BMSCs的特性

在目前研究的干細(xì)胞中，應(yīng)用較為廣泛的就是BMSCs。它具有其他干細(xì)胞所沒有的的特性：（1）具有多向分化潛能，在適當(dāng)條件下可被誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞；（2）從骨髓中容易分離，在適宜的培養(yǎng)環(huán)境中能快速貼壁生長(zhǎng)，容易純化，可成倍擴(kuò)增，且具有遺傳穩(wěn)定性，在傳代后仍能保持原來的細(xì)胞特性，不會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化；（3）可分泌多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子能改善重要器官的功能；（4）具有低免疫源性，這種特性的存在降低了BMSCs移植后所產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)和相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生；（5）易導(dǎo)入外源基因，并可以持續(xù)地表達(dá)該基因，可以提高BMSCs移植的存活率，促血管生長(zhǎng)等作用。這些特性決定BMSCs適合作為一種種子細(xì)胞進(jìn)行有效的移植治療[2]。

3 修飾BMSCs的生物活性因子

生物活性因子主要有轉(zhuǎn)錄因子、營(yíng)養(yǎng)及生長(zhǎng)因子、信號(hào)分子及其通路等。下面將介紹近年來主要應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)方面的生物活性因子。

3.1 轉(zhuǎn)錄因子

GATA-4作為一種特定的蛋白轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)和存活的過程中起著至關(guān)重要的作用。它可以促進(jìn)血管生成、增加細(xì)胞存活和分化，減少心肌細(xì)胞的凋亡。李紅霞等[3]探討了GATA-4過表達(dá)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞保護(hù)心肌細(xì)胞的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明GATA-4轉(zhuǎn)染后，增加了BMSCs轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞，并對(duì)心肌梗死后的重構(gòu)產(chǎn)生很大的作用。

SOX9基因是軟骨類細(xì)胞分化的一個(gè)必需轉(zhuǎn)錄因子，它除了是維持軟骨表型的主要調(diào)控基因之外，還可以增加Ⅱ型膠原及聚集蛋白聚糖（Aggrecan）基因的表達(dá)水平。許云等[4]探討了SOX9基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并誘導(dǎo)其向髓核樣細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究，選用SOX9、Ⅱ型膠原及Aggrecan作為BMSC向髓核樣細(xì)胞分化的特征指標(biāo)，結(jié)果表明過表達(dá)SOX9基因特定環(huán)境中能促進(jìn)骨、關(guān)節(jié)及軟骨細(xì)胞的再分化。

低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor 1α）是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，目前被認(rèn)為是最具有前途的治療基因之一。它具有促進(jìn)血管新生、上調(diào)下游靶基因、改善組織的血液供應(yīng)等作用。王君等[5]探討了大鼠低氧誘導(dǎo)因子-1α基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后BMSCs具有向神經(jīng)干細(xì)胞分化的潛能，并可維持該細(xì)胞的特點(diǎn)。更有研究發(fā)現(xiàn)，不同類型的HIF-1α基因誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均能向心肌細(xì)胞分化，為兩者的聯(lián)合應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)[8]。endprint

還有很多相關(guān)的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，如Tbx-5和NKX2-5等均可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化[6]；Mef2c基因參與介導(dǎo)骨骼肌、心肌以及平滑肌細(xì)胞的分化過程；Cbfa-1基因則可促使骨髓干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[7]。

3.2 營(yíng)養(yǎng)因子及生長(zhǎng)因子

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種高度特異性細(xì)胞因子，具有促進(jìn)缺血心肌的毛細(xì)血管的再生，恢復(fù)血管內(nèi)皮的正常組織結(jié)構(gòu)及其生理功能，最終起到改善器官組織微循環(huán)的作用。楊鍇等[8]研究探討了VEGF基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療對(duì)大鼠心肌梗死組織血管再生以及心功能的影響，可明顯改善缺血心肌的心功能，促進(jìn)血管再生和心肌細(xì)胞的形成。

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblastgrowth factor，bFGF）是調(diào)控增殖及定向分化的首選生長(zhǎng)因子之一，也是一種重要的營(yíng)養(yǎng)因子，具有刺激新生血管形成，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)和纖維再生的作用，同時(shí)對(duì)軟骨細(xì)胞的分化和增殖也具有生物學(xué)效應(yīng)，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的促細(xì)胞生長(zhǎng)因子?？婞S泰等[9]研究了堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子體外誘導(dǎo)犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化，還得出了bFGF體外誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞分化的最適濃度（10?/L），為今后的研究提供了證據(jù)。

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glialcell line-derivedneurotrophic factor，GDNF）是一種強(qiáng)效的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，除對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用外，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的分化、發(fā)育、生長(zhǎng)和存活具有重要意義。杜杰等[10]探討了GDNF基因修飾的BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)，試驗(yàn)結(jié)果提示GDNF具有誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的作用。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中的重要成員，可以促進(jìn)感覺神經(jīng)元譜系分化，維持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育及修復(fù)有重要的保護(hù)作用。于澤洋等[11]研究發(fā)現(xiàn)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子轉(zhuǎn)染BMSCs可以有效表達(dá)該蛋白，并且使BMSCs向成骨細(xì)胞的分化進(jìn)程加快，對(duì)骨折后損傷部位的組織修復(fù)等具有重要的作用，為臨床疾病提供了新的方向。

血管生成素-1（Angiopoietin-1）是一類重要的血管生長(zhǎng)因子，可以提高血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活力，對(duì)細(xì)胞凋亡有著抑制作用，可使血管通透性降低，減少血管的萎縮和退化。侯淑紅等[12]研究了Ang-1基因修飾骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植后心肌梗死大鼠的心功能變化，不僅穩(wěn)定了Ang-1基因的表達(dá)，提高了BMSCs存活率，而且對(duì)新生血管起到了很好的調(diào)控作用，改善了梗死心肌的功能。

血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ）是一種細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有調(diào)節(jié)水鈉代謝及血管張力的生理作用，可刺激血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的增生，還可誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞[13]。張蕾等[14]研究還發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ聯(lián)合生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化。

胰島素樣生長(zhǎng)因子1（Insulin-like growthfactor 1）是軟骨發(fā)育過程中一種強(qiáng)有力的合成代謝刺激生長(zhǎng)因子，能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和成熟，延緩基質(zhì)的降解，抑制軟骨細(xì)胞的凋亡。鄔波等[15]探討了胰島素樣生長(zhǎng)因子1對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨分化及基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響，結(jié)果顯示胰島素樣生長(zhǎng)因子1能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，還可保護(hù)軟骨膠原纖維的穩(wěn)定性。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β， TGF-β）是屬于TGF-β超家族的一組重要的生長(zhǎng)因子，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、黏附和凋亡具有調(diào)控作用。目前研究較多的是TGF-β1和TGF-β3。呂洋等[16]采用了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行定向誘導(dǎo)，得到其定向可分化為心肌樣細(xì)胞，且分化的細(xì)胞還具有心肌細(xì)胞的特性。而王體俊等[17]研究了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因共轉(zhuǎn)染骨髓干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TGF-β3能增加骨形態(tài)發(fā)生蛋白的誘導(dǎo)成骨量，從而促進(jìn)BMSCs的分化。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（Bonemorphogenetic protein2）是一種多功能的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，在骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中是骨誘導(dǎo)性能最強(qiáng)的，對(duì)骨形成有調(diào)控作用。段智霞等[18]通過實(shí)驗(yàn)證明骨形成蛋白2活性多肽在體外能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化，且這種誘導(dǎo)效應(yīng)存在明顯的劑量依賴關(guān)系。

還有一些營(yíng)養(yǎng)因子如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（NT）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF），均能促使BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化[19-21]；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）體外誘導(dǎo)BMSCs可向肝細(xì)胞分化[22]；血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）則可促使BMSCs向心肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分化。

3.3 信號(hào)分子及信號(hào)通路

Wnt信號(hào)通路是一條高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)通路。Wnt家族成員通過自分泌或旁分泌作用與細(xì)胞膜上的受體相結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞增殖及遷移，心臟及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，干細(xì)胞分化及增殖等多種生理過程和腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等病理過程中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。近年來已有研究證實(shí)Wnt信號(hào)通路參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的定向分化及增殖的過程[23]。Wnt基因家族中研究最多的當(dāng)屬Wnt3a，Wnt5a和Wnt7a這三種蛋白信號(hào)因子。Wnt3a主要促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞以及成骨細(xì)胞的分化，且可使體外培養(yǎng)的BMSCs大量增殖[24]。沈亞莉等[25]的研究證明了通過腺病毒實(shí)現(xiàn)了外源性wnt5a基因轉(zhuǎn)染bMSCs，促進(jìn)了BMSCs的增殖。而Wnt7a對(duì)促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化有重要作用[26]。endprint

Notch信號(hào)通路是一條保守而重要的通路。Notch通路幾乎涉及到了所有的細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的分化、增殖及凋亡起到了重要的調(diào)控作用。Notch信號(hào)通路還參與BMSCs分化的調(diào)節(jié)過程。柳柯等[27]研究了Notch信號(hào)通路在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)特征，用實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)到在Notch信號(hào)通路中關(guān)鍵因子的表達(dá)作用，為干細(xì)胞的臨床未來治療提供了基礎(chǔ)。

Hedgehog信號(hào)通路是一條保守而高效的通路，對(duì)各種組織器官的形態(tài)功能有著調(diào)節(jié)作用。Hedgehog家族蛋白是一種分泌型信號(hào)蛋白，主要包括Shh、Ihh和Dhh。其中的Shh和Ihh，不僅能調(diào)控成骨細(xì)胞的分化，還能促進(jìn)BMSCs的增殖分化[28]。Hedgehog信號(hào)通路被抑制劑激活后還能抑制BMSCs向脂肪細(xì)胞分化[29]。目前尚有許多關(guān)于Hedgehog信號(hào)通路及相關(guān)分子機(jī)制研究的不確定性，還需要我們進(jìn)一步去證實(shí)。

4 存在問題及展望

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是重要的組織工程學(xué)細(xì)胞，具有廣闊的應(yīng)用前景，它可以誘導(dǎo)分化為多種細(xì)胞，如心肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。而基因?qū)撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞的修飾作用，不僅可以增強(qiáng)其定向分化的能力，還能促進(jìn)細(xì)胞的增殖，調(diào)控細(xì)胞的凋亡。目前骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究已經(jīng)取得了很多的成績(jī)，但還有很多問題需要我們?nèi)ソ鉀Q，比如如何提高被修飾后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的機(jī)體存活率；某些基因?qū)撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞的作用機(jī)制尚不是很清楚，應(yīng)用于人體當(dāng)中會(huì)不會(huì)有負(fù)性作用，還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

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（收稿日期：2014-04-10）endprint