乳腺浸潤性導(dǎo)管癌連接蛋白43和上皮性鈣黏蛋白相關(guān)性研究

，， ，

(解放軍第174醫(yī)院普通外科，福建 廈門 361003)

連接蛋白43(Connexin43，Cx43)和上皮性鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)的表達(dá)情況及功能狀態(tài)已被證實(shí)與多種人類疾病有關(guān)。目前，也有學(xué)者對(duì)兩者的表達(dá)相關(guān)性關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诜伟⒔Y(jié)腸癌、膀胱癌、喉癌等均有一定同向性及一致性。Cx43和E-cad同為表達(dá)于相鄰細(xì)胞膜跨膜蛋白，共同對(duì)維持細(xì)胞間的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)與調(diào)節(jié)細(xì)胞間的信息傳遞有著重要意義。為了解它們二者的表達(dá)是否具有相關(guān)性，作者對(duì)89例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中的Cx43和E-cad的表達(dá)情況進(jìn)行相關(guān)性分析，然后對(duì)48例分區(qū)取材的乳腺癌標(biāo)本中Cx43和E-cad在同向表達(dá)時(shí)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)進(jìn)行分析，探討二者聯(lián)合檢測(cè)時(shí)是否有助于判斷乳腺腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移能力。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2010年9月至2013年10月本院普通外科收治的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌89例手術(shù)切除標(biāo)本，每例病例在同一方向連續(xù)分3區(qū)取材，分別為腫瘤區(qū)，交界區(qū)，遠(yuǎn)癌區(qū)。腫瘤區(qū)為手術(shù)標(biāo)本中腫瘤活檢部分；交界區(qū)為腫瘤活檢邊緣外1～2 cm處的含有乳腺腺體組織部分；遠(yuǎn)癌區(qū)為腫瘤活檢邊緣外2～4 cm處的含有乳腺腺體組織部分，分區(qū)檢測(cè)標(biāo)本共有48例。將所有取材組織標(biāo)記后制作成蠟塊標(biāo)本。所有病例資料完整，患者年齡36～68歲，中位年齡52歲；TNM Ⅰ期9例(18.7%)，Ⅱ期26(54.2%)例，13例(27.1%)；病理組織學(xué)Ⅰ級(jí)2例(4.2%)，Ⅱ級(jí)9例(18.7%)，Ⅲ級(jí)37例(77.1%)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例(52.0%)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例(48.0%)。所有病例術(shù)前均未進(jìn)行放、化療及內(nèi)分泌治療；手術(shù)方式為乳腺癌根治切除術(shù)或改良根治術(shù)；均由術(shù)后常規(guī)病理證實(shí)診斷為浸潤性導(dǎo)管癌；關(guān)于病理分級(jí)及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也經(jīng)由病理確診；伴有其他部位的原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤均未入組。

1.2 試劑

Cx43多克隆抗體(ZA-0444,即用型)購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；E-cad單克隆抗體(MAB-0589，即用型)及ElivisionTM Plus二步法試劑盒、DAB顯色劑購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)

采用Elivision免疫組化法，石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化；檸檬酸高溫高壓修復(fù)2 min；3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶活性15～20 min；滴加I抗后置37 ℃水育箱孵育50 min；按說明先后加增強(qiáng)劑和酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物，分別室溫孵育20 min、30 min；DAB顯色30 s,蘇木素復(fù)染,脫水，封片。每批染色均設(shè)立以PBS代替I抗的陰性對(duì)照及陽性對(duì)照(陽性對(duì)照Cx43為Wistar雄性大鼠心臟,E-cad用已知的陽性切片)。

1.4 結(jié)果判定

Cx43的判定參考高一菁的方法[1]：著色細(xì)胞小于10%(0分)；10%～40%(1分)；41%～70%(2分)；>70%為3分；著色強(qiáng)度計(jì)分:無著色(0分)；淡黃色(1分)；棕黃色(2分)。兩項(xiàng)相乘，總計(jì)分0～3分為異常表達(dá)(-)；4分以上為正常表達(dá)(+)。E-cad陽性細(xì)胞為黃色-棕黃色著色。按陽性細(xì)胞比例: 陽性細(xì)胞數(shù)<10%(0分) , 10%～40%(1分)，41～70%(2分)，>70%(3分)。按組織的著色強(qiáng)度：不著色(0分)，淡黃色(1分)，黃色(2分)，棕黃色(3分)。6分以下為減弱表達(dá)(-)，6分以上為正常表達(dá)(+)。結(jié)果由2名正高病理醫(yī)師獨(dú)立評(píng)分，同一病例評(píng)分取平均值作為該病例的最終評(píng)分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析運(yùn)用SPSS 19.0軟件，Cx43與E-cad的表達(dá)關(guān)系分析采用配對(duì)計(jì)數(shù)資料的McNemar檢驗(yàn)和Kappa檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cx43與E-cad在浸潤性導(dǎo)管癌的表達(dá)

在乳腺癌組織中Cx43蛋白表達(dá)明顯下降，隨著病理組織學(xué)分級(jí)的上升而減弱(圖1)。E-cad在乳腺癌組織中,E-cad表達(dá)胞膜處，少數(shù)出現(xiàn)細(xì)胞漿異位表達(dá)，隨腫瘤病理組織學(xué)分級(jí)的升高，表達(dá)減弱甚至缺失(見圖1)。

a：Cx43蛋白表達(dá)明顯減弱，少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)胞核異位表達(dá)；b：E-cad的表達(dá)明顯減弱

圖1浸潤性導(dǎo)管癌中III級(jí)Cx43及E-cad的表達(dá)( EP×100)

2.2 浸潤性導(dǎo)管癌Cx43與E-cad表達(dá)的相關(guān)性

89例浸潤性導(dǎo)管癌組織中,Cx43和E-cad同時(shí)呈陽性表達(dá)31例，同時(shí)呈陰性表達(dá)34例。采用交叉表卡方檢驗(yàn)，P<0.001，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示兩個(gè)基因的表達(dá)相關(guān)聯(lián)。經(jīng)相關(guān)性檢驗(yàn)求得列聯(lián)系數(shù)r=0.460(P<0.001)。采用Kappa分析對(duì)兩者表達(dá)的結(jié)果進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，求得K=0.510(P<0.001),見表1。

表1 Cx43與E-cad蛋白的表達(dá)關(guān)系

2.3 Cx43與E-cad 在乳腺癌3區(qū)中表達(dá)的相關(guān)性

48例乳腺癌手術(shù)標(biāo)本分別檢測(cè)腫瘤區(qū)、交界區(qū)及遠(yuǎn)癌區(qū)組織中Cx43和E-cad，分別獲得同時(shí)呈陽性表達(dá)及同時(shí)呈陰性表達(dá)例數(shù)，并計(jì)算各組列聯(lián)系數(shù)，采用Kappa分析對(duì)二者表達(dá)的結(jié)果進(jìn)行內(nèi)部一致性檢驗(yàn)，求得K值(表2)。

2.4 Cx43與E-cad 共同表達(dá)和乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

腫瘤區(qū)及交界區(qū)中隨著Cx43和E-cad陰性表達(dá)出現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率逐漸增高，各組間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；遠(yuǎn)癌區(qū)中各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.341)，見表3。

表2 CX43與E-cad在乳腺癌3區(qū)中表達(dá)的相關(guān)性(例)

表3CX43與E-cad在乳腺癌3區(qū)中表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性[例(%)]

組別CX43+E-cad+CX43+E-cad-+CX43-E-cad+ CX43-E-cad-χ2P腫瘤區(qū)3(17.6)8(61.5)14(77.8)13.3050.001交界區(qū)8(30.8)8(72.7)9(81.8)10.5080.005遠(yuǎn)癌區(qū)19(47.5)4(80.0)2(67.7)2.1540.341

3 討論

在乳腺癌的治療上，無論是手術(shù)方式還是放化療方案都已日趨成熟[2]，但是仍有50%左右的患者在治療后5年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)而導(dǎo)致治療失敗。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者的主要死因，也是影響乳腺癌預(yù)后的主要因素。因此從腫瘤生物學(xué)角度認(rèn)識(shí)并尋求更合理、更準(zhǔn)確預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移的檢測(cè)方法和標(biāo)志性指標(biāo)是一研究熱點(diǎn)。E-cad通過介導(dǎo)Ca2+依賴性細(xì)胞間隙連接形成途徑，促進(jìn)Cx向胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，并引導(dǎo)由Cx43聚合的連接子對(duì)頭鉚接成間隙連接通道[3-6]。有研究發(fā)現(xiàn)Cx43可誘導(dǎo)E-cad的表達(dá)，并促進(jìn)其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜，從而加強(qiáng)了細(xì)胞間隙連接通訊[7-9]。Bao等[10]認(rèn)為鈣黏蛋白是Cx組配的最主要因素之一，Cx43[11-12]及E-cad[13-15]與乳腺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。

本研究通過檢測(cè)89例浸潤性導(dǎo)管癌組織發(fā)現(xiàn)，Cx43和E-cad的同向表達(dá)例數(shù)占總病例數(shù)的73.0%(65/89),證實(shí)二者在同一標(biāo)本中的表達(dá)確有一定的正相關(guān)性。48例分區(qū)取材檢測(cè)結(jié)果提示，Cx43和E-cad在腫瘤區(qū)、交界區(qū)、遠(yuǎn)癌區(qū)均有一定的相關(guān)性和較好的一致性。分區(qū)取材的研究結(jié)果說明，Cx43和E-cad在腫瘤區(qū)、交界區(qū)中Cx43和E-cad共同表達(dá)與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有相關(guān)，且當(dāng)Cx43和E-cad同時(shí)為陰性表達(dá)時(shí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率最高(77.8%)，與其它學(xué)者研究相仿[16-18]。說明在浸潤性導(dǎo)管癌組織中，E-cad通過調(diào)節(jié)Cx43聚合和轉(zhuǎn)運(yùn)從而促進(jìn)了間隙連接的形成；缺乏E-cad使腫瘤細(xì)胞的間隙連接形成減少，腫瘤細(xì)胞也因缺乏間隙連接通信的監(jiān)控從而易于脫落發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此我們認(rèn)為Cx43和E-cad的表達(dá)下降可能是乳腺浸潤性導(dǎo)管癌發(fā)生和發(fā)展過程中的共同事件，聯(lián)合檢測(cè)Cx43和E-cad可作為判斷乳腺癌愈后的生物學(xué)指標(biāo)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 高一菁,陳 戰(zhàn),李 銳.連接蛋白43和上皮細(xì)胞鈣黏蛋白在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中表達(dá)的意義[J].中華乳腺病雜志(電子版),2012,6(3)：26-29.

[2] 蔡新良，鄭業(yè)華，龔 劍，等.基于計(jì)算機(jī)視覺的早期乳腺癌放射治療一體化擺位系統(tǒng)研究[J].局解手術(shù)學(xué)雜志，2012,21(1)：6-9.

[3] Alexander DB,Goldberg GS.Transfer of biologically important molecules between cells through gap junction channels[J].Curr Med Chem,2003,10(19):2045-2058.

[4] Berx G,Staes K,Van Hengel J,et al.Cloning and characterization of the human invasion suppressor gene E-cadherin (CDH1)[J].Genomics,1995,26(2):281-289.

[5] Li MW,Mruk DD,Lee WM,et al.Connexin 43 is critical to maintain the homeostasis of the blood-testis barrier via its effects on tight junction reassembly[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(42):17998-18003.

[6] Chakraborty S,Mitra S,Falk MM,et al.E-cadherin differentially regulates the assembly of Connexin43 and Connexin32 into gap junctions in human squamous carcinoma cells[J].J Biol Chem，2010，285(14):10761-10776.

[7] Gao FH,Wang Q,Wu YL,et al.c-Jun N-terminal kinase mediates AML1-ETO protein-induced connexin-43 expression[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,356(2):505-511.

[8] Yano T,Yamasaki H.Regulation of cellular invasion and matrix metallo Proteinase activity in Hep G2 cell by connexin 26 transfection[J].Mol Carcinog,2001,31(2):101-109.

[9] Govindarajan R,Chakraborty S,Johnson KE,et al.Assembly of connexin43 into gap junctions is regulated differentially by E-cadherin and N-cadherin in rat liver epithelial cells[J].Mol Biol Cell,2010,21(23):4089-4107.

[10] Bao B,Jiang J,Yanase T,et al.Connexon-mediated cell adhesion drives microtissue self-assembly[J].FASEB J,2011,25(1):255-264.

[11] Laird DW,Fistouris P,Batist G,et al.Deficiency of Connexin43 gap junctions is an independent marker for breast tumors[J].Cancer Res,1999,59(5):4104- 4110.

[12] 杜俊澤，范林軍，齊曉偉，等.MicroRNA-206可能通過調(diào)控Cx43表達(dá)調(diào)節(jié)人乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，3(2)：115-120.

[13] Dong C,Wu Y,Yao J,et al.G9a interacts with Snail and is critical for Snail-mediated E-cadherin repression in human breast cancer[J].J Clin Invest ,2012,122(4):1469-1486.

[14] 李 忠，董 鵬，高默杰,等.上皮細(xì)胞鈣粘蛋白與乳腺癌研究進(jìn)展[J].武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008，17(11)：1023-1025.

[15] 黃 平，匡久樹.乳腺癌手術(shù)治療后血清E-cad、CA153和VEGF水平檢測(cè)的臨床意義[J].醫(yī)學(xué)信息,2009,12(22)：2767-2769.

[16] 王曉琳,呂世軍.連接蛋白43在乳腺癌組織及癌前病變組織中的表達(dá)意義[J].腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2010,23(4):292-295.

[17] Jamieson S,Going JJ,D’Arcy R,et al.Expression of gap junction proteins connexin 26 and connexin 43 in normal human breast and in breast tumours[J].J Pathol,1998,184(1):37-43.

[18] Frixen UH,Behrens J,Sachs M,et al.E-cadherin-mediated cell-cell adhesion prevents invasiveness of human carcinoma cells[J].J Cell Biol,1991,113(1):173-185.