利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析不同保種場(chǎng)的保種效果

任 康，張 權(quán)，肖 煒，云 鵬，寧中華，侯卓成*

(1.北京市畜牧總站，北京 100107；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193)

北京油雞和北京鴨是我國(guó)優(yōu)良的地方品種。北京油雞以肉味鮮美、蛋品優(yōu)良等特點(diǎn)而著稱；北京鴨則具有早期生長(zhǎng)速度快、肉質(zhì)優(yōu)良、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。兩品種在我國(guó)均有相應(yīng)的保種場(chǎng)。目前的保種效果如何，以及同一品種的保種場(chǎng)間的差異等問題一直是保種工作中較為關(guān)注的重點(diǎn)。利用分子標(biāo)記分析各保種場(chǎng)保種群體的遺傳基礎(chǔ)可以從本質(zhì)上闡明這些問題。微衛(wèi)星是目前普遍使用的分子遺傳學(xué)標(biāo)記。微衛(wèi)星標(biāo)記具有多態(tài)性高、共顯性、易于鑒定、檢測(cè)重復(fù)性好、在基因組中廣泛分布等優(yōu)點(diǎn)[1]，目前在遺傳圖譜的構(gòu)建[2]、QTL定位[3]、分子遺傳多樣性研究[4]、家系鑒定等方面得到普遍應(yīng)用。本研究以微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)不同保種場(chǎng)的保種效果進(jìn)行分析，旨在評(píng)價(jià)同一品種在不同保種場(chǎng)中的保種現(xiàn)狀和效果，從而為探討更合理、更有效的保種方案提供研究手段和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用北京油雞由兩個(gè)不同北京油雞保種場(chǎng)(北京油雞Ⅰ，北京油雞Ⅱ)提供，北京鴨由兩個(gè)不同的北京鴨保種場(chǎng)(北京鴨Ⅰ，北京鴨Ⅱ)提供。北京鴨、北京油雞保種場(chǎng)都采用家系留種的方法進(jìn)行留種。北京鴨保種場(chǎng)Ⅰ的保種群體規(guī)模為500只左右，采用公母1∶5的交配比例，組建家系留種。北京鴨保種場(chǎng)Ⅱ的保種群體規(guī)模為360只左右，每個(gè)保種場(chǎng)也是采用1∶5的方法組建家系留種。兩個(gè)北京油雞的保種場(chǎng)規(guī)模的留種群體在1 200(北京油雞Ⅰ)～1 500只(北京油雞Ⅱ)左右。每個(gè)保種場(chǎng)的采樣樣本量均為60只，公母比例為1∶1，并盡量保持各個(gè)個(gè)體之間無(wú)血緣關(guān)系。于翅下靜脈采血1 mL，置于含有0.1 mL抗凝劑的離心管中，混勻后置于-20 ℃低溫保存。

1.2 微衛(wèi)星引物、熒光標(biāo)記多重PCR擴(kuò)增及其檢測(cè)

按照檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)上的微衛(wèi)星，選取的北京油雞23個(gè)微衛(wèi)星座位分別為MCW0081、ADL176、MCW150、ADL123、LEI0166、MCW4、MCW0183、ADL225、MCW120、MCW104、LEI0066、ADL185、MCW0085、ADL212、MCW67、ADL201、MCW264、MCW0014、MCW330、ADL136、MCW 294、MCW0295和MCW174。北京鴨23個(gè)微衛(wèi)星座位分別為APH01、APL80、APL81、SM011、APH10、APL82、CM012、SM013、APH09、APH11、APL26、APL78、APL79、APL83、SM06、SM07、APH14、APL36、CM011、SM010、APH07、APL77和SM09。

1.3 多重PCR擴(kuò)增

根據(jù)熒光標(biāo)記引物的顏色、擴(kuò)增產(chǎn)物分子量及退火溫度，對(duì)引物選擇組合，每組引物的數(shù)量為3～4對(duì)，對(duì)所有材料進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中DNA模板(20 ng/μL)1 μL，10×PCR mix 10 μL，引物(10 μmol/L)0.3 μL，ddH2O 8.4 μL。PCR擴(kuò)增測(cè)序(以退火溫度55 ℃為例)為95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存待用。

1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物純化

毛細(xì)管電泳對(duì)DNA的純度要求非常嚴(yán)格，應(yīng)盡量去除殘留的鹽分、蛋白質(zhì)、殘留的去污劑及RNA。

1.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)

在96孔板的每個(gè)孔中分別加1 μL純化的PCR產(chǎn)物，9 μL甲酰胺和0.18 μL內(nèi)標(biāo)，3 000 r/min離心1 min；然后95 ℃變性5 min，置冰上10 min，離心后用ABI 3700進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

1.6 數(shù)據(jù)分析

待電泳完畢，對(duì)樣品的原始數(shù)據(jù)用Genescan 3.7和Genotyper 3.7兩套軟件共同完成分析任務(wù)。用基因掃描程序Genescan進(jìn)行微衛(wèi)星原始數(shù)據(jù)掃描與分析，統(tǒng)計(jì)96個(gè)泳道的空道數(shù)，并計(jì)算每板樣品的通過率(成功率)，作為檢驗(yàn)與校正儀器電泳效果的依據(jù)。一般應(yīng)將無(wú)峰樣品的比例控制在5 %以內(nèi)。在峰圖掃描過程中，將Genescan 3.7程序的兩大參數(shù)Size Standard和Parameters分別設(shè)置為GS500-250.szs 與GS500 Analysis.gsp。然 后 用Genotyper 3.7軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析，從而確定不同樣品擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。對(duì)分析的全部樣品而言，一些品種擴(kuò)增產(chǎn)物的變異會(huì)超出設(shè)定的預(yù)計(jì)范圍，需要對(duì)Genotyper程序得到的部分?jǐn)?shù)據(jù)加以校正。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用PopGen32軟件(verion1.6)[5]計(jì)算等位基因頻率、雜合度(Heterozygosity，H)、F統(tǒng)計(jì)量、遺傳距離，計(jì)算公式參考Nei (1987) Molecular Evolutionary Genetics，并根據(jù)Botstein等的公式[5]應(yīng)用picale軟件(verion 0.6)計(jì)算多態(tài)信息含量(PIC)。

2 結(jié)果

2.1 地方品種微衛(wèi)星座位的等位基因數(shù)、平均雜合度與多態(tài)信息含量

測(cè)定的北京油雞和北京鴨所有23個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記中，均表現(xiàn)出多態(tài)性，分別檢測(cè)到210、196個(gè)等位基因。各標(biāo)記的等位基因數(shù)目有一定差異：北京油雞Ⅱ標(biāo)記MCW0183的等位基因數(shù)最多：14個(gè)；北京油雞Ⅰ標(biāo)記ADL201與北京油雞Ⅰ、Ⅱ標(biāo)記MCW150的等位基因數(shù)最少，均為2個(gè)。北京油雞Ⅰ、Ⅱ的23個(gè)微衛(wèi)星座位的平均等位基因數(shù)分別為6.8和7.2，平均期望雜合度分別為0.729 7和0.683 0，平均多態(tài)信息含量分別為0.699和0.533。北京油雞Ⅰ座位MCW0183的等位基因數(shù)、平均多態(tài)信息含量和期望雜合度最高，除座位MCW150、ADL201為中低度多態(tài)外，其余微衛(wèi)星座位的PIC均為高度多態(tài)位點(diǎn)；北京油雞Ⅱ座位MCW0183的等位基因數(shù)和平均多態(tài)信息含量最高，座位ADL136的期望雜合度最高，除座位ADL123、ADL185、MCW0085、ADL136、ADL201、MCW294和MCW174為中低度多態(tài)外，其余微衛(wèi)星座位的PIC均為高度多態(tài)位點(diǎn)。北京鴨Ⅱ標(biāo)記SM011的等位基因數(shù)最多：16個(gè)，北京鴨Ⅱ標(biāo)記APL82為純合狀態(tài)。北京鴨Ⅰ、Ⅱ的23個(gè)微衛(wèi)星座位的平均等位基因數(shù)分別為6.6和6.8，平均期望雜合度分別為0.540 6和0.551 3，平均多態(tài)信息含量分別為0.498和0.508。北京鴨Ⅰ座位APL80的等位基因數(shù)、平均多態(tài)信息含量和期望雜合度最高，11個(gè)微衛(wèi)星座位的PIC為高度多態(tài)位點(diǎn)；北京鴨Ⅱ座位APL80的期望雜合度和平均多態(tài)信息含量最高，座位SM011的等位基因數(shù)最高，15個(gè)微衛(wèi)星座位的PIC為高度多態(tài)位點(diǎn)。4個(gè)群體中，北京油雞Ⅰ的平均期望雜合度和平均多態(tài)信息含量最高，北京油雞Ⅱ 的等位基因數(shù)量最多；北京鴨Ⅰ的平均期望雜合度、平均多態(tài)信息含量和平均等位基因數(shù)量均為最低。

23個(gè)微衛(wèi)星座位在北京油雞與北京鴨各群體中的等位基因數(shù)、期望雜合度和多態(tài)信息含量見表1、表2。

表1 北京油雞23個(gè)微衛(wèi)星座位的等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量和雜合度

表2 北京鴨23個(gè)微衛(wèi)星座位的等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量和雜合度

2.2 F-統(tǒng)計(jì)量

F-統(tǒng)計(jì)量是用來測(cè)量群體間遺傳分化程度的指標(biāo)，通過每個(gè)座位的固定指數(shù)Fis、Fit和Fst檢驗(yàn)群體的分化程度。北京油雞和北京鴨各23個(gè)微衛(wèi)星座位的F-statistics分析結(jié)果見表3、表4。23個(gè)微衛(wèi)星座位在北京油雞2個(gè)群體內(nèi)的固定系數(shù)(Fst)在0.449 1(ADL123)和0.009 0(MCW150)之間變動(dòng)，平均值為0.170 6。整個(gè)群體的個(gè)體固定系數(shù)(Fis)為0.689 3(MCW294)～-0.228 0(MCW150)，均值為0.157 6。北京鴨23個(gè)微衛(wèi)星座位在2個(gè)群體內(nèi)的固定系數(shù)(Fst)在0.289 6(SM010)～0.000 0(APL82)之間變動(dòng)，平均值為0.030 1。整個(gè)群體的個(gè)體固定系數(shù)(Fis)為1.000(APH11、APL83、APH14、SM010)～-0.178 8(APH09)，均值為0.263 3。對(duì)于北京油雞和北京鴨兩個(gè)群體而言，北京油雞的群體遺傳分化程度較高，遺傳分化系數(shù)達(dá)到0.157 6。

表3 北京油雞F-statistics 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

表4 北京鴨F-statistics 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

2.3 遺傳距離的估計(jì)

遺傳距離是度量群體間遺傳變異的尺度。本研究根據(jù)北京油雞和北京鴨各自的23個(gè)微衛(wèi)星座位上的等位基因頻率，通過PopGen32軟件計(jì)算不同群體之間的遺傳相似度和遺傳距離，結(jié)果見表5、表6。北京油雞群體間的遺傳相似性和遺傳距離分別為0.400 1和0.915 3；北京鴨群體間的遺傳相似性和遺傳距離為0.914 3和0.089 6。結(jié)果表明，北京油雞和北京鴨兩個(gè)品種的不同群體間存在遺傳分化，北京油雞不同群體間的分化程度較高。

表5 北京油雞遺傳相似系數(shù)和遺傳距離

表6 北京鴨遺傳相似度和遺傳距離

3 討 論

從本研究的結(jié)果可以看出，23個(gè)微衛(wèi)星座位在研究北京油雞和北京鴨時(shí)，呈現(xiàn)出不同的多態(tài)現(xiàn)象。通過分析遺傳雜合度(H)和多態(tài)信息含量(PIC)，可以看出不同座位在不同群體中的遺傳變異程度不同。北京油雞的兩個(gè)群體所有位點(diǎn)雜合度均值都超過0.6，PIC 值也均大于0.5。北京鴨兩個(gè)群體所有位點(diǎn)雜合度均值超過0.5，PIC值也在0.5左右。根據(jù)Vanhala[6]確定的微衛(wèi)星位點(diǎn)PIC大于0.5時(shí)，屬于高度多態(tài)座位的標(biāo)準(zhǔn)，表明除了北京鴨Ⅰ外，其余3個(gè)群體均屬于高度多態(tài)群體。本研究中的北京油雞平均雜合度與多態(tài)信息含量均高于吳信生等[7]所報(bào)道；北京油雞平均雜合度比高玉時(shí)等[8]報(bào)道的北京油雞平均雜合度略高，但多態(tài)信息含量又略低于其報(bào)道；本研究中的北京鴨平均雜合度和多態(tài)信息含量略高于湯青萍等[9]報(bào)道，其原因可能是選取的微衛(wèi)星標(biāo)記以及微衛(wèi)星座位數(shù)的多少不同所造成，這也反映保種場(chǎng)較好的保種效果，維持了中國(guó)地方雞品種內(nèi)具有較高雜合度的重要特點(diǎn)，也實(shí)現(xiàn)了盡量不使未來可能利用的遺傳基因丟失的保種目的。

從研究結(jié)果中我們也能看到同一品種間的差異。在許多微衛(wèi)星位點(diǎn)中，即使是同一品種，其等位基因數(shù)以及種類也有差異，如試驗(yàn)中的MCW174位點(diǎn)在北京油雞Ⅰ中有9個(gè)等位基因，而在北京油雞Ⅱ中則有6個(gè)等位基因，北京鴨標(biāo)記APL82在北京鴨Ⅰ中有6個(gè)等位基因，而在北京鴨Ⅱ中則表現(xiàn)為純合位點(diǎn)。同時(shí)，即使是等位基因一致，其基因頻率、雜合度和PIC值也不盡相同，這表明同一品種在保種場(chǎng)之間也已經(jīng)有了一定的差異和分化。產(chǎn)生差異和分化的原因可能與保種的原始群體、保種的方法、環(huán)境的影響以及實(shí)驗(yàn)中的誤差有關(guān)。

通過Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，4個(gè)群體的大多數(shù)微衛(wèi)星座位處于平衡狀態(tài)，反映了所抽取的樣本和樣本量基本能反映群體的實(shí)際情況，少數(shù)幾個(gè)座位處于不平衡狀態(tài)。這可能是樣本或檢測(cè)方法引起。在微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測(cè)時(shí)，存在于檢測(cè)樣本中的微衛(wèi)星位點(diǎn)的部分等位基因可能檢測(cè)不到，從而造成“啞等位基因”[10～11]的出現(xiàn)，進(jìn)而造成該位點(diǎn)的純合子過多的現(xiàn)象。處于不平衡狀態(tài)的位點(diǎn)，同時(shí)具有較大的Fis值，反映該位點(diǎn)雜合子遠(yuǎn)低于期望雜合子數(shù)目。北京油雞23個(gè)位點(diǎn)的Fst均值約為17%，可以解釋為群體間的差異。

從遺傳距離來看，北京油雞和北京鴨品種內(nèi)保種場(chǎng)間的遺傳相似系數(shù)分別為0.4和0.9，表明北京油雞保種場(chǎng)間有了一定的遺傳分化。根據(jù)他人實(shí)驗(yàn)結(jié)果[12～15]，可以看出兩個(gè)品種的兩個(gè)保種群均產(chǎn)生了分化，北京鴨兩個(gè)保種場(chǎng)的遺傳距離為0.089 6，而北京油雞保種場(chǎng)的遺傳距離則達(dá)到0.915 3。盡管北京油雞的群體規(guī)模比較大，但是兩個(gè)保種場(chǎng)之間的遺傳距離顯著大于兩個(gè)北京鴨保種場(chǎng)之間的遺傳距離。從分析結(jié)果來看，北京鴨在兩個(gè)保種場(chǎng)之間采用合適的保種方法，從而能較好地保護(hù)北京鴨群體的多樣性以及品種的基因。需要對(duì)兩個(gè)北京油雞保種場(chǎng)的保種、引種等做進(jìn)一步調(diào)查，研究?jī)蓚€(gè)群體之間遺傳距離增加的原因。適當(dāng)增加保種群體的大小和場(chǎng)間的交流，在一定程度上可以減小差異的存在，進(jìn)而達(dá)到更好的保種效果。

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Abstract：Twenty-three microsatellite markers were used to analyze the conservation efficiency of two local breeds (Beijing Fatty Chicken and Beijing Duck) in different farms.Genotypes were detected in 240 samples.The genetic variations among and within the populations were calculated by the number of alleles，genetic heterozygosity (H)，Polymorphism Information Content (PIC)，F(xiàn)-statistics，Nei’s genetic distance.High polymorphism were found in the two local breeds，and H values of each population were more than 0.5.All loci detected in this study showed polymorphism and the number of alleles ranged from 2 to 16，in addition to APL82 (Beijing Duck Ⅱ) homozygous loci.The different farms for the two breeds were shown to have retained substantial biodiversity，indicating that the conservation programs are efficient.However，differences between the farms of the same breeds were observed.

Keywords： conservation；Beijing Fatty Chicken；Beijing Duck；microsatellite