紅景天提取物對胰島素抵抗大鼠肝臟過氧化物酶體增殖物激活受體-γ mRNA表達(dá)的影響

王崢嶸 張鴻雁 凌 鑫 宋光耀 劉 淼 馬艷艷

(河北省中醫(yī)院腫瘤二科，河北 石家莊 050011)

紅景天提取物對胰島素抵抗大鼠肝臟過氧化物酶體增殖物激活受體-γ mRNA表達(dá)的影響

王崢嶸 張鴻雁1凌 鑫2宋光耀3劉 淼4馬艷艷5

(河北省中醫(yī)院腫瘤二科，河北 石家莊 050011)

目的觀察中藥紅景天提取物對高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠胰島素敏感性及過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)mRNA表達(dá)的影響。方法將70只Wistar大鼠隨機(jī)分為2組，正常對照組20只，高脂模型組50只。正常對照組給予基礎(chǔ)飼料，高脂模型組給予高脂飼料，均喂養(yǎng)4周后2組各隨機(jī)選取10只大鼠行高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)判斷造模是否成功，確認(rèn)造模成功后將剩余高脂模型組大鼠隨機(jī)分為高脂對照組和高脂+紅景天干預(yù)組，每組20只。高脂+紅景天干預(yù)組給予紅景天提取物1g/(kg·d)灌胃，正常對照組及高脂對照組給予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃，其他飼養(yǎng)條件不變，繼續(xù)喂養(yǎng)4周。觀察比較各組大鼠造模后和灌胃4周后血清甘油三酯(TG)、血清總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)、空腹血糖(FPG)及空腹血清胰島素(FINS)的含量變化，并記錄葡萄糖輸注率(GIR)變化及PPAR-γ mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果高脂模型組大鼠造模后與正常對照組比較FPG、FINS明顯升高(P<0.05)，GIR明顯下降(P<0.05)；高脂對照組灌胃4周后與正常對照組比較TG、TC及FFA水平均明顯升高(P<0.05)，高脂+紅景天干預(yù)組較高脂對照組TC、TG及FFA水平均明顯下降(P<0.05)，與正常對照組水平相當(dāng)(P>0.05)；高脂對照組灌胃4周后與正常對照組比較FPG、FINS明顯升高(P<0.05)，GIR明顯下降(P<0.05)，高脂+紅景天干預(yù)組較高脂對照組FPG、FINS水平明顯下降(P<0.05)，GIR明顯升高(P<0.05)，與正常對照組水平相當(dāng)相(P>0.05)；高脂對照組灌胃4周后PPAR-γ mRNA表達(dá)水平與正常對照組表達(dá)水平相當(dāng)(P>0.05)，高脂+紅景天干預(yù)組較正常對照組及高脂對照組比較PPAR-γ mRNA表達(dá)水平均有明顯升高(P<0.05)。結(jié)論紅景天提取物對大鼠的胰島素抵抗有顯著地改善作用，降低血清TG、TC及FFA明顯降低，調(diào)節(jié)FPG平衡，降低FINS水平，增加GIR，提高胰島素敏感性，提示其作用機(jī)制可能與提高胰島素抵抗大鼠肝臟細(xì)胞PPAR-γ mRNA表達(dá)有關(guān)。

胰島素抗藥性；紅景天；過氧化物酶體增殖物激活受體；大鼠：動物，實(shí)驗(yàn)；RNA

隨著人們物質(zhì)生活水平提高，日常膳食中高脂肪等高熱量食物攝入增加，使高脂血癥、冠心病、脂肪肝、2型糖尿病的發(fā)病率日益增長，大量研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗是這些疾病的共同發(fā)病基礎(chǔ)。過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)是調(diào)節(jié)胰島素敏感性的一個重要因子，大量的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)PPARs具有多種生物學(xué)功能，如增強(qiáng)機(jī)體對胰島素敏感性、調(diào)解體內(nèi)糖平衡，尤其是在脂肪分化與脂質(zhì)代謝調(diào)控等方面起到重要作用，和高脂血癥密切相關(guān)[1]。紅景天提取物是中藥紅景天根部的提取物，氣香甜、味苦澀，主要成分為紅景天苷和紅景天苷元，具有增強(qiáng)免疫功能、保護(hù)心腦血管等功效。本實(shí)驗(yàn)研究擬通過觀察紅景天提取物對高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型大鼠肝臟細(xì)胞PPAR-γ mRNA表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討其改善胰島素抵抗的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動物 清潔級健康雄性Wistar大鼠70只，月齡16～20周，體質(zhì)量250～300g，均購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號：604095。

1.1.2 藥品與試劑 紅景天提取物，諾迪康膠囊(主要成分為圣地紅景天，西藏諾迪康藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z10980020，批號050410)；基礎(chǔ)飼料及高脂飼料，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；胰島素放射免疫分析藥盒、RNA提取試劑Trizol Reagant，美國Invitrogen公司；定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒，中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司；溴化乙啶(EB)、電泳buffer液、硼酸、Tris、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)，華美生物工程公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇等RNA提取試劑均為分析純，天津市泰興試劑廠。

1.1.3 儀器 Advantage血糖儀，美國羅氏公司；Beckman X20全自動生化分析儀，美國貝克曼庫爾特有限公司；實(shí)時熒光定量PCR儀(ABI 7300)，美國ABI公司；PCR儀(PE9600)，美國Perkin Elmer公司；紫外分光光度計(756MC)，上海精密儀器科學(xué)有限公司；臺式離心機(jī)(LDZ5-2型)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；低溫離心機(jī)(EBA12R)，德國Hettich公司；電動超細(xì)勻漿器(F6/10)，上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組及給藥 全部70只大鼠給予常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，然后隨機(jī)分為2組，正常對照組20只，高脂模型組50只。正常對照組給予基礎(chǔ)飼料，熱量組成：碳水化合物占65.5%，脂肪占10.3%，蛋白質(zhì)占24.2%；高脂模型組給予高脂飼料，熱量組成：碳水化合物占20.1%，脂肪占59.8%，蛋白質(zhì)占20.1%。2組大鼠喂養(yǎng)4周后，各組隨機(jī)選10只大鼠，禁食12h，行高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)[2]，判斷造模是否成功。確認(rèn)造模成功后將剩余高脂模型組大鼠隨機(jī)分為高脂對照組和高脂+紅景天干預(yù)組，每組20只。高脂+紅景天干預(yù)組給予紅景天提取物1g/(kg·d)灌胃，正常對照組及高脂對照組給予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃，其他飼養(yǎng)條件不變，繼續(xù)喂養(yǎng)4周。

1.2.2 高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)[2]

1.2.2.1 插管 高脂飲食喂養(yǎng)4周后正常對照組和高脂模型組組各隨機(jī)取10只大鼠，禁食水12h后，以戊巴比妥鈉60mg/kg腹腔內(nèi)麻醉，在麻醉狀態(tài)下分離皮下組織和肌肉，分離單側(cè)的頸靜脈和頸動脈，進(jìn)行單側(cè)頸靜脈和頸動脈插管，插管后保留4～5cm導(dǎo)管經(jīng)皮下從頸后引出，用100U/mL肝素溶液1mL及粘堵劑封管，用縫線及膠布固定在頸后皮膚上。對頸部傷口噴灑抗生素(如慶大霉素)，并依次縫合肌肉、皮下組織及皮膚，待大鼠清醒后單籠飼養(yǎng)，繼續(xù)給予基礎(chǔ)或高脂飼料喂養(yǎng)。

1.2.2.2 高胰島素-正葡萄糖鉗夾術(shù) 插管3d后，禁食水12h，在清醒狀態(tài)下行高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)。頸靜脈導(dǎo)管通過三通接頭連接雙通道微量輸液泵，一端接胰島素輸液泵(濃度為40mU/mL胰島素)，另一端接葡萄糖輸液泵(濃度為30%的葡萄糖)，頸動脈導(dǎo)管遠(yuǎn)端連接裝有50U/mL肝素溶液的注射器，避免在取血樣時發(fā)生凝血。待大鼠平靜20～30min后，自頸動脈導(dǎo)管取血1mL，測定基礎(chǔ)血糖和胰島素。待基礎(chǔ)血糖穩(wěn)定后，在大鼠清醒狀態(tài)下開始持續(xù)輸注胰島素，速度為4mU/(kg·min)，并同時按5mg/(kg·min)的速率輸注葡萄糖。每10min頸動脈取血測定血糖，根據(jù)血糖值調(diào)整葡萄糖輸注速度，使大鼠血糖保持在實(shí)驗(yàn)前空腹血糖(FPG)±0.5mmol/L的范圍內(nèi)，當(dāng)連續(xù)5次血糖都在上述范圍時即為穩(wěn)態(tài)形成，記錄穩(wěn)態(tài)下5～6次葡萄糖輸注速率(GIR)的平均值作為大鼠胰島素敏感性的評價指標(biāo)。

1.3 觀察指標(biāo)及方法 各組大鼠于造模后和灌胃4周時禁食12h后心臟采血檢測血清甘油三酯(TG)、血清總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)、FPG及空腹血清胰島素(FINS)的含量變化，并記錄GIR變化及PPAR-γ mRNA的表達(dá)情況。TC、TG采用Beckman X20全自動生化分析儀測定；FFA采用銅顯色法測定；FINS采用胰島素放射免疫分析藥盒測定；FPG采用羅氏Advantage血糖儀；PPAR-γ mRNA表達(dá)采用熒光定量PCR技術(shù)檢測。稱取80mg肝臟組織，剪碎，加入Trizol液1mL，充分勻漿，按照Trizol試劑說明書提取總RNA，取總RNA 400ng采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。PPAR-γ上游引物為5'-TGGAGTCCACGCATGTGAAG-3'，下游引物為5'-CGCCAGCTTTAGCCGAATAG-3'，擴(kuò)增片段64bp，反應(yīng)條件：93℃ 3min，然后93℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，進(jìn)行40個循環(huán)。采用PE9600熒光定量PCR儀進(jìn)行模板cDNA含量的測定。取值目的基因PPAR-γ mRNA的起始拷貝數(shù)與內(nèi)參基因GAPDH mRNA起始拷貝數(shù)的比值進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 正常對照組與高脂模型組造模后FPG、FINS及GIR水平比較 見表1。

nFPG(mmol/L)FINS(mmol/L)[GIRmg/(kg·min)]正常對照組204．78±0．1411．76±3．0629．36±7．07高脂模型組505．34±0．11?13．97±0．44?20．99±4．30?

與正常對照組比較，*P<0.05

由表1可見，高脂模型組造模后FPG、FINS及GIR水平與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)PG、FINS明顯升高，GIR明顯下降。

2.2 各組灌胃4周后TG、TC及FFA水平比較 見表2。

nTGTCFFA正常對照組100．59±0．090．81±0．09676．3±138．5高脂對照組200．74±0．04?1．01±0．01?1252．4±432．6?高脂+紅景天干預(yù)組200．58±0．11△0．78±0．14△680．3±164．9△

與正常對照組比較，*P<0.05；與高脂對照組比較，△P<0.05

由表2可見，高脂對照組灌胃4周后TG、TC及FFA水平與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，均明顯升高；高脂+紅景天干預(yù)組灌胃4周后TC、TG及FFA水平與高脂對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與正常對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，TC、TG及FFA水平較高脂對照組均明顯下降，與正常對照組水平相當(dāng)。

2.3 各組灌胃4周后FPG、FINS及GIR水平比較 見表3。

nFPG(mmol/L)FINS(mmol/L)[GIRmg/(kg·min)]正常對照組104．86±0．1412．36±3．0630．36±7．07高脂對照組205．52±0．11?19．97±7．44?19．99±4．3?高脂+紅景天干預(yù)組204．92±0．11△12．74±0．14△24．6±5．47△

與正常對照組比較，*P<0.05；與高脂對照組比較，△P<0.05

由表3可見，高脂對照組灌胃4周后FPG、FINS及GIR與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)PG、FINS升高，GIR降低；高脂+紅景天干預(yù)組灌胃4周后FPG、FINS及GIR與高脂對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與正常對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，F(xiàn)PG、FINS水平較高脂對照組均明顯下降，GIR升高，與正常對照組水平相當(dāng)相比。

2.4 各組灌胃4周后PPAR-γ mRNA表達(dá)水平比較 見表4。

正常對照組(n=10)高脂對照組(n=20)高脂+紅景天干預(yù)組(n=20)PPAR-γmRNA0．3674±0．12090．3916±0．12484．450±1．6464?△

與正常對照組比較，*P<0.05；與高脂對照組比較，△P<0.05

由表4可見，高脂對照組灌胃4周后PPAR-γ mRNA表達(dá)水平與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表達(dá)水平相當(dāng)；高脂+紅景天干預(yù)組灌胃4周后PPAR-γ mRNA表達(dá)水平與正常對照組及高脂對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，均有明顯升高。

3 討 論

胰島素抵抗是多種疾病共同發(fā)病基礎(chǔ)，如2型糖尿病、肥胖、高脂血癥、冠心病等。過氧化物酶體是具有多種功能的細(xì)胞器，如參與脂肪酸的氧化等，過氧化物酶體功能缺陷可以引起多種疾病。過氧化物酶體能在許多結(jié)構(gòu)不同的化學(xué)物質(zhì)作用下增生，這些物質(zhì)被稱為過氧化物酶體增殖劑。PPAR有3種亞型，即PPAR-α、PPAR-γ、PPAR-β，其中PPAR-α和PPAR-γ分別對調(diào)控肝細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的代謝功能發(fā)揮重要作用。許多飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸都是PPAR的配體，PPAR經(jīng)由這些生理濃度的天然配體活化后，能夠調(diào)控脂肪酸的過氧化物酶氧化和線粒體氧化，同時還能調(diào)節(jié)脂質(zhì)的攝取和貯存，在脂質(zhì)代謝中占有重要地位，在維持體內(nèi)脂質(zhì)代謝的動態(tài)平衡中起到樞紐作用[3]。

中醫(yī)學(xué)中并無與胰島素抵抗相對應(yīng)的病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)可診斷為眩暈、濕阻、消渴等疾病，認(rèn)為其發(fā)病多與痰濕、脾虛、氣虛、血瘀等幾方面有關(guān)。紅景天為景天科紅景天屬植物高山紅景天和狹葉紅景天的干燥全草，因其花、莖、根及其浸液均呈紅色而得名，具有益氣補(bǔ)血、活血化瘀、通脈止痛、扶正固本、調(diào)和陰陽、益氣補(bǔ)血、滋補(bǔ)強(qiáng)身等作用。近年來研究表明，紅景天提取物對延緩機(jī)體衰老、防止老年疾病、改善心肌缺血缺氧、改善心律失常、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂等疾病都有很好的療效[4]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紅景天提取物可使高脂飲食誘導(dǎo)的高脂胰島素抵抗大鼠血清TG、TC及FFA明顯降低，調(diào)節(jié)FPG平衡，降低FINS水平，增加GIR，提高胰島素敏感性。通過熒光定量PCR法測定顯示，紅景天提取物可顯著增加大鼠肝臟PPAR-γ mRNA的表達(dá)，提示其可能通過作為PPAR的配體，激活PPAR受體并使其活化，從而啟動了一系列與糖脂代謝有關(guān)酶的基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)脂肪氧化分解，從而增強(qiáng)胰島素敏感性，為臨床應(yīng)用中醫(yī)藥防治胰島素抵抗提供了理論依據(jù)，也為進(jìn)一步研究中醫(yī)藥治療心血管和內(nèi)分泌疾病提供新的治療靶點(diǎn)。

[1] 韓勇，沙杜鵑，張均.過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子-1α在腦缺血中的神經(jīng)保護(hù)作用[J].國際腦血管病雜志，2012，20(8)：631-636.

[2] Kraegen EW，James DE，Bennett SP，et al.In vivo insulin sensitivity in the rat determined by euglycemic clamp[J].Am J Physiol，1983，245(1)：E1-7.

[3] Banner CD，Gottlicher M，Widmark E，et al.A systematic analytical chemistry/cell assay approach to isolate activators of orphan nuclear receptors from biological extracts：characterization of peroxisome proliferator-activated receptor activators in plasma[J].J Lipid Res，1993，34(9)：1583-1591.

[4] 趙文，王庭欣.藏產(chǎn)紅景天混合提取物對BALB/c小鼠免疫功能的影響[J].實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)與管理，1998，15(2)：2-4.

(本文編輯：石 康)

EffectofRhodiolaroseaextractontheexpressionofPpar-γininsulinresistancehyperlipidrathepatic

WANGZhengrong*,ZHANGHongyan,LINGXin,etal.

*TumorDepartmentTwo,HebeiProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Hebei,Shijiazhuang050011

ObjectiveTo observe the effect of Rhodiola rosea extract on insulin sensitivity and the expression of Ppar-γ in rats with insulin resistance induced by diets.Methods70Wistar rats were randomly divided into two groups, normal control group (n=20) and hyperlipid model group (n=50).Normal control group given basic feed, hyperlipid model group was given a high-fat feed, feed four weeks later each line 10rats were randomly selected high insulin - glucose clamps test to determine whether a building is successful, confirmed after the success of the building will be residual fatty model group rats were randomly divided into the hyperlipid control group and hyperlipid + rhodiola intervention group, each group of 20rats.Rats in hyperlipid + rhodiola intervention group were given Rhodiola rosea extract (1g/kg·d).Rats in normal control group and hyperlipid control group were given equal amount of 0.9% sodium chloride injection by intragastric administration.After four weeks The changes of TG, TC, FFA, FBG and FINS in each group were observed, GIR changes and the expression of Ppar-γ mRNA were recorded.ResultsFBG and FINS of rats in hyperlipid model group were increased obviously compared with those in normal control group (P<0.05), GIR was deceased (P<0.05).The levels of TG, TC and FFA in hyperlipid model group were increased obviously compared with those in normal control group (P<0.05).The levels of TG, TC and FFA in hyperlipid + rhodiola intervention group were decreased obviously compared with those in hyperlipid model group (P<0.05).The levels of TG, TC and FFA were comparable level with the control group (P> 0.05).The level of the expression of Ppar-γ mRNA in hyperlipid control group was rather with that in normal control group (P>0.05).The level of the expression of Ppar-γ mRNA in hyperlipid + rhodiola intervention group was significantly increased as compared with that in hyperlipid model group and normal control group and control group (P<0.05).ConclusionRhodiola rosea extract has obvious improvement role on insulin resistance of rats, significantly lower serum TG, TC and FFA, adjust the balance of FBG, lower levels of FINS, increase the GIR, improve insulin sensitivity and its mechanism may be related to increase insulin resistance in rat liver cells ppar-gamma mRNA expression

Insulin resistance；Rhodiola rosea；Peroxisome proliferator-activated receptor；Rat；Animal；Experiment；RNA

王崢嶸(1980—)，女，主治醫(yī)師，碩士。從事中醫(yī)內(nèi)科臨床工作。

R-332；R285.5

A

1002-2619(2014)10-1548-04

2013-11-19)

1 華北石油管理局總醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 任丘 062552

2 華北石油機(jī)關(guān)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，河北 任丘 062552

3 河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 石家莊 050051

4 河北省中醫(yī)院治未病科，河北 石家莊 050011

5 華北石油管理局總醫(yī)院心內(nèi)二科，河北 任丘 062552