腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜中TNF-α、TGF-β1和VEGF表達(dá)的影響

郭立霞 徐育冬 王浩 朱明華

·論著·

腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜中TNF-α、TGF-β1和VEGF表達(dá)的影響

郭立霞 徐育冬 王浩 朱明華

目的探討腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1 (TGF-β1)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的影響。方法將成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為5組，Ⅱ～Ⅴ組建立佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠(AA)模型，于造模后第12天開始Ⅲ組給予甲氨喋呤灌胃治療，Ⅳ～Ⅴ組給予益賽普皮下注射治療。第28天取膝關(guān)節(jié)滑膜，常規(guī)HE染色，計算滑膜病理積分，免疫組織化學(xué)染色檢測TNF-α、TGF-β1和VEGF在膝關(guān)節(jié)滑膜的表達(dá)。結(jié)果正常對照組大鼠滑膜組織均有少量TNF-α、TGF-β1和VEGF的表達(dá)，Ⅱ～Ⅴ組較Ⅰ組均明顯增高(P<0.05)。Ⅳ、Ⅴ組滑膜組織TNF-α表達(dá)較Ⅱ組明顯減低(P<0.05)，而Ⅲ組與Ⅱ組無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Ⅲ～Ⅴ組滑膜組織TGF-β1、VEGF的表達(dá)均明顯低于Ⅱ組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論可溶性重組人腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白可明顯降低AA大鼠滑膜組織TNF-α、TGF-β1和VEGF表達(dá)，對AA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥有明顯的治療作用，可能抑制局部組織血管新生。

佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠；可溶性重組人腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白(益賽普)；腫瘤壞死因子-α；轉(zhuǎn)化生長因子-β1；血管內(nèi)皮生長因子

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性進(jìn)行性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜炎，對稱性和破壞性關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕卣?。血管新生促進(jìn)滑膜血管翳的發(fā)生和發(fā)展，維持血管翳的侵襲性，促進(jìn)軟骨和骨破壞及關(guān)節(jié)重塑，最終造成關(guān)節(jié)畸形、強(qiáng)直和功能喪失。TGF-β屬于生長因子超家族，具有調(diào)節(jié)創(chuàng)傷愈合、成纖維細(xì)胞增生和血管新生等功能，VEGF是促進(jìn)血管新生的關(guān)鍵因子，可能在RA發(fā)病機(jī)制中起重要作用。在細(xì)胞因子相互作用的網(wǎng)絡(luò)中TNF-α居于中心位置，是RA滑膜炎發(fā)生和持續(xù)的一個關(guān)鍵性因子[1]。益賽普(腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白)是一種拮抗TNF-α的生物制劑，目前已應(yīng)用于臨床，治療效果優(yōu)于傳統(tǒng)的抗風(fēng)濕藥。但國內(nèi)對于益賽普能否抑制促進(jìn)血管增生的細(xì)胞因子TGF-β1、VEGF分泌罕有報道。本試驗以佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠模型為基礎(chǔ)，觀察益賽普對關(guān)節(jié)炎的影響，評價其療效，探討益賽普治療RA的機(jī)制、臨床應(yīng)用價值及其對滑膜組織血管增生的抑制情況。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 動物 Wistar大鼠90只，雄性，體重140～160 g，由河北省實驗動物中心提供，合格證號 802120，許可證號SCXK(冀) 2003-1-003。完全弗氏佐劑(FCA，10 ml)購于Sigma公司，卡介苗(BCG，50 mg/支) 購自華瑞創(chuàng)新生物科技開發(fā)中心。TNF-α免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物制品公司，TGF-β1、VEGF免疫組化成套試劑盒購自晶美生物制品公司。

1.2 分組及AA大鼠模型的建立 將90只雄性Wistar大鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，分別編號Ⅰ～Ⅴ組，Ⅰ組10只，Ⅱ～Ⅴ組，每組20只。Ⅰ組為正常對照組，Ⅱ組為單純造模組，Ⅲ組為造模+甲氨喋呤組，Ⅳ組為造模+益賽普低劑量組(0.44 mg/kg)，Ⅴ組為造模+益賽普高劑量組(0.88 mg/kg)。將FCA與卡介苗配置為含BCG 10 mg/ml 的水包油乳劑。試驗第一天在第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組大鼠的尾根部皮內(nèi)注射該乳劑0.2 ml致炎，誘發(fā)佐劑性關(guān)節(jié)炎。而正常對照組大鼠的尾根部皮內(nèi)注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.3 給藥 于致炎后第12～23天Ⅳ、Ⅴ組皮下注射益賽普，Ⅳ組予以益賽普0.44 mg·kg-1·d-1，Ⅴ組予以益賽普0.88 mg·kg-1·d-1。給藥容積均為0.1 ml/100 g，連續(xù)12 d。Ⅲ組大鼠給予甲氨喋呤2.7 mg·kg-1·周-1灌胃，Ⅱ組大鼠蒸餾水灌胃0.5 ml·只-1·d-1；給藥時間均固定在每天上午9∶00。

1.4 病理學(xué)及免疫組織化學(xué)檢測 于致炎后第28天，處死所有大鼠并取膝關(guān)節(jié)滑膜組織，置于4%多聚甲醛固定液中固定，以備作病理及免疫組織化學(xué)檢測。常規(guī)HE染色并計算滑膜病理積分，按照程度不同分別評分[2]：0分：正常；1 分：極少炎性細(xì)胞浸潤或(和)組織輕微水腫；2分：輕微浸潤；3分：中等浸潤；4分：明顯浸潤；5分：嚴(yán)重浸潤。免疫組化檢測用SABC (鏈霉親和素生物素酶復(fù)合物)法，TNF-α、TGF-β1和VEGF陽性滑膜細(xì)胞均呈顆粒狀棕黃色或棕褐色。采用真彩色圖像分析系統(tǒng)對TNF-α、TGF-β1和VEGF表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。方法[3]如下：每張切片隨機(jī)選取5個視野(×200)，系統(tǒng)自動測量出陽性染色部位的積分光密度(IOD)，5個視野的平均IOD值代表該切片TNF-α、TGF-β1和VEGF的表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，采用單因素方差分析，相關(guān)性采用直線相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 第Ⅱ～Ⅴ組大鼠造模后共有38只于第15～19天先后出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅、腫等關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)，給藥期間第Ⅱ組死亡1只，Ⅲ、Ⅳ組各有1只受傷，剔出死亡、受傷及造模不成功的大鼠后，最終入選實驗統(tǒng)計結(jié)果的實驗動物共計45只，Ⅰ、Ⅱ組各10只，Ⅲ、Ⅳ組各9只，Ⅴ組7只。

2.2 大鼠滑膜病理學(xué)改變及病理學(xué)評分 正常大鼠滑膜襯里層有1～2層滑膜細(xì)胞組成，且部分不連續(xù)?；ひr里層下層為由脂肪細(xì)胞、少量成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和少量血管組成的結(jié)締組織?；そM織無炎性細(xì)胞浸潤，無纖維組織增生。單純造模組可見滑膜組織中等量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤，平均病理積分3.8±0.45，滑膜襯里層增生達(dá)4～6層。Ⅲ～Ⅴ組滑膜組織病理積分均明顯低于Ⅱ組，并具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)；Ⅴ組滑膜組織病理積分低于Ⅲ組，且有統(tǒng)計學(xué)差異；Ⅳ組滑膜組織病理積分與Ⅲ、Ⅴ組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表3。

表3 大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜病理學(xué)積分

表3 大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜病理學(xué)積分

組別分?jǐn)?shù)Ⅰ組(n=10)0Ⅱ組(n=10)3.8±0.4Ⅲ組(n=9)2.8±0.8*Ⅳ組(n=9)2.4±0.6#Ⅴ組(n=7)2.0±0.7#

注：與Ⅱ組比較，*P<0.05，#P<0.01

2.3 滑膜組織TNF-α、TGF-β1和VEGF的表達(dá) 正常對照組大鼠滑膜組織均有少量TNF-α、TGF-β1和VEGF的表達(dá)。與Ⅰ組相比：Ⅱ～Ⅴ組均明顯增高，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與Ⅱ組相比：Ⅳ、Ⅴ組滑膜組織TNF-α表達(dá)較Ⅱ組明顯減低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；Ⅲ組TNF-α表達(dá)雖低于Ⅱ組，但無統(tǒng)計學(xué)意義。Ⅲ～Ⅴ組滑膜組織TGF-β1、VEGF的表達(dá)均明顯低于Ⅱ組且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Ⅳ、Ⅴ組滑膜組織TNF-α表達(dá)低于Ⅲ組，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Ⅴ組滑膜組織TNF-α表達(dá)低于Ⅳ且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Ⅲ、Ⅳ組滑膜組織TGF-β1、VEGF的表達(dá)均高于Ⅴ組，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Ⅲ與Ⅳ組之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4，圖1～8。

表4 大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織TNF-α、TGF-β1和VEGF的IOD值

組別TNF-αTGF-β1VEGFⅠ組237±48183±28193±14Ⅱ組1105±186#1020±230#1030±248#Ⅲ組1053±129# 733±125#△ 668±129#☆Ⅳ組 835±109#☆ 709±118#☆ 641±108#☆Ⅴ組 661±84#☆ 499±99#☆ 440±62*☆

注：與Ⅰ組比較，*P<0.05，#P<0.01;與Ⅱ組比較，△P<0.05，☆P<0.01

3 討論

益賽普(Etanercept)即注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白，是一種可抑制TNF-α功能的生物制劑。目前益賽普抗炎療效的可能的機(jī)制包括：(1)減少炎癥部位的細(xì)胞生成；(2)下調(diào)滑膜細(xì)胞因子的表達(dá)；(3)降低血漿MMP-1和MMP-3的水平；(4)可調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡[4]。許多研究結(jié)果顯示，應(yīng)用益賽普治療的RA患者關(guān)節(jié)炎癥明顯好轉(zhuǎn)。TGF-β1和VEGF在血管新生的病理和生理中炎癥具有重要作用。有研究認(rèn)為TGF-β1誘導(dǎo)滑膜血管增生是通過刺激滑膜細(xì)胞分泌VEGF來實現(xiàn)的。RA滑膜組織中TGF-β1表達(dá)增多，調(diào)節(jié)FGF從而影響血管新生和滑膜細(xì)胞增殖。研究顯示，在體內(nèi)TNF-α啟動VEGF生成以促進(jìn)血管新生，抗TNF-α治療可降低VEGF生成及與RA相關(guān)的血管新生，使增生血管復(fù)原[5，6]?？筎NF-α制劑，在體外培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞可抑制VEGF生成[7]。本試驗顯示，益賽普可抑制滑膜組織TNF-α、TGF-β1和VEGF的過度表達(dá)。益賽普治療組滑膜組織TNF-α的表達(dá)低于單純造模組，而甲氨喋呤組與單純造模組無統(tǒng)計學(xué)差異，說明益賽普可降低滑膜組織TNF-α的表達(dá)。益賽普治療組滑膜組織TGF-β1、VEGF的表達(dá)均明顯低于單純造模組，高劑量組明顯低于甲氨喋呤組，而低劑量組與甲氨喋呤組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。說明益賽普可以降低AA大鼠滑膜組織TGF-β1、VEGF的表達(dá)，抑制新生血管形成，從而減少血管翳的形成。益賽普治療組大鼠滑膜組織病理積分均明顯低于單純造模組；高劑量組明顯低于甲氨喋呤組，而低劑量組與甲氨喋呤組無統(tǒng)計學(xué)意義。說明益賽普可以有效抑制或延緩AA大鼠關(guān)節(jié)病理改變，減輕關(guān)節(jié)病變程度且成劑量依賴性。與甲氨喋呤治療組比較，益賽普高劑量組在TNF-α、TGF-β1和VEGF在滑膜的表達(dá)、滑膜病理積分均明顯降低，而低劑量組與甲氨喋呤組無統(tǒng)計學(xué)差異，說明益賽普起效早于甲氨喋呤，近期效果優(yōu)于甲氨喋呤，這可能與給藥方法不同，以及甲氨喋呤起效緩慢有關(guān)，但遠(yuǎn)期療效尚有待觀察。本試驗說明：經(jīng)益賽普治療的AA大鼠，從滑膜TNF-α、TGF-β1和VEGF水平、滑膜病理積分幾方面均顯著低于未經(jīng)治療的AA大鼠，近期療效優(yōu)于甲氨喋呤，其機(jī)制可能與益賽普中和TNF-α，抑制了TNF-α促炎因子的作用，從而間接抑制了對血管翳形成直接造成軟骨和骨破壞起主要作用的TGF-β1、VEGF的表達(dá)有關(guān)。益賽普作為一種新興的生物制劑，對于傳統(tǒng)的抗風(fēng)濕藥而言，尤其是對傳統(tǒng)抗風(fēng)濕藥物禁忌、耐藥和毒副作用較為嚴(yán)重的RA患者，可作為新一類的治療藥物以供臨床選擇。

圖1 正?；そM織(×400)

圖2 佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)骨膜(HE) (×400)

圖3 TNF-α在正?；そM織的表達(dá)(×400)

圖4 TNF-α在佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜的表達(dá)(×400)

圖5 VEGF在正?；そM織的表達(dá)(×400)

圖6 VEGF在佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜的表達(dá)(×400)

圖7 TGF-β1在正?；そM織的表達(dá)(×400)

圖8 TGF-β1 在佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜的表達(dá)(×400)

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Effect of rhu-TNFR-Fc on the expression of TNF-α,TGF-β1 and VEGF in synovium of rats with adjuvant arthritis

GUOLiXia,XUYuDong,WANGHao,etal.DepartmentofUrology,GeneralHospitalofNorthernChinaPetroleumAdministrationBureau,Hebei,Renqiu062552,China

ObjectiveTo investigate the effect of rhu-TNFR-Fc (etanercept) on the expression of TNF-α,TGF-β1 and VEGF in synovium of rats with adjuvant arthritis (AA).MethodsThe adult male Wistar rats were randomly divided into 5 groups: the rats in group Ⅱ～Ⅴ were injected with Freund complete adjuvant to induce the experimental animal models with AA,on the 12th day after induction,the rats in group Ⅲ were given MTX (2.7mg/kg.w) by gavage;the rats in groupⅣ and group Ⅴwere given etanercept by subcutaneous injection.After 28 days,the synovium of joint of rats was taken out to be HE stained,then synovium pathological score was calculated,and the expression levels of TNF-α,TGF-β1 and VEGF protein in synovium of knee joint were detected by histoimmunochemistry.ResultsThe expression levels of TNF-α,TGF-β1 and VEGF in group Ⅱ～Ⅴ were significantly higher than those in groupⅠ(P<0.05),The expression levels of TNF-α in group Ⅳ and group Ⅴ were obviously decreased,as compared with those in group Ⅱ (P<0.05),however,there were no significant differences between group Ⅲ and group Ⅱ (P>0.05).The expression levels of TGF-β1 and VEGF in rats' synovium tissues in group Ⅲ～Ⅴ were significantly lower than those in group Ⅱ(P<0.05).ConclusionEtanercept can obviously reduce the expression levels of TNF-α,TGF-β1 and VEGF in rats' synovium tissues,which has obvious therapeutic effect on joint inflammation of rats with AA.which may inhibit blood vessel neogenesis in local tissues.

adjuvant-induce-arthritis rat;rhu-TNFR-Fc;tumor necrosis factor-α;transforming growth factor-β1;vascular endothelial growth factor

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.07.002

062552 河北省任丘市，華北石油管理局總醫(yī)院腎內(nèi)科

R 593.22

A

1002-7386(2014)07-0969-003

2013-11-07)