水稻光敏色素A基因克隆及其在光形態(tài)建成中的作用

陳 由, 王亞琴

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室,廣州 510631)

對高等植物而言, 光不僅是光合作用的能量來源, 同時也是一種重要的環(huán)境信號. 高等植物利用光敏色素(phytochromes, phy)、隱花色素(cryptochromes)和向光素(phototropins)等光受體時刻監(jiān)測著其生長環(huán)境中光質(zhì)、光強、光周期等條件的變化，不斷調(diào)節(jié)自己的生長發(fā)育，以最大限度適應(yīng)周圍環(huán)境[1-4]. 其中, 光敏色素主要感受紅光(red light, R)和遠(yuǎn)紅光(far-red light, FR)，參與調(diào)節(jié)植物生命循環(huán)中多個重要發(fā)育過程[2,5]. 在各種光敏色素中，phyA主要負(fù)責(zé)對遠(yuǎn)紅光的感知，調(diào)節(jié)高輻照度反應(yīng)(High irradiance response,HIR)和介導(dǎo)黃化苗的極低輻照度反應(yīng)(very low fluence response, VLFR). PhyA是一種植物自身合成的色素蛋白質(zhì)，由生色團(chromophore)和脫輔基蛋白(apoprotein)2部分組成，在細(xì)胞質(zhì)中合成后，必須從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核才能與核內(nèi)的其他蛋白質(zhì)相互作用[3-4,6-7], 從而或正或負(fù)影響植物光形態(tài)建成的發(fā)生, 如種子萌發(fā)、幼苗去黃化、避陰反應(yīng)、光周期開花和育性等[2,8-11].

水稻(OryzasativaL.)作為世界上最重要的糧食作物之一，是單子葉植物基因組學(xué)遺傳和功能研究的模式植物.水稻光敏色素基因家族包括3個成員：PHYA,PHYB和PHYC[12-13].研究發(fā)現(xiàn)水稻phyA, phyB和phyC在幼苗光形態(tài)建成中具有重要作用，3種光敏色素介導(dǎo)的光信號均能夠抑制胚芽鞘的延伸，誘導(dǎo)光調(diào)控基因(LHCB和RBCS)的表達[8,14].水稻PHYA在光形態(tài)建成中具體的作用是什么呢？它是否能夠影響水稻的其它農(nóng)藝性狀？在本研究中，作者分析了OsPHYA在水稻中的表達分布及其在水稻光形態(tài)建成中的作用，包括極低輻照度和高輻照度下水稻胚芽鞘伸長、極低輻照度下的萌發(fā)率、去黃化過程中葉綠素的合成以及水稻成熟期的農(nóng)藝性狀等.結(jié)果表明，OsphyA在黑暗中積累，表達不具有組織特異性，OsphyA在水稻幼苗光形態(tài)建成中起主導(dǎo)作用，但對水稻成熟期農(nóng)藝性狀的影響不明顯.本研究克隆了水稻OsPHYA基因.

1 材料與方法

1.1 植物材料

水稻光敏色素A突變體phyA(NC2788和NC2793)及其對應(yīng)的野生型(WT)均為日本晴品種(OryzasativaL.), 突變體的遺傳背景是phyA4[15].

1.2 水稻的種植

將種子剝?nèi)シf殼, 先用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇表面消毒1 min, 無菌水清洗3次, 再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的次氯酸鈉溶液殺菌消毒15 min, 期間時常振蕩, 最后用無菌水沖洗5次, 轉(zhuǎn)移到無菌濾紙上吸干表面的水分, 均勻接種在MS固體培養(yǎng)基上, 用封口膜封好后, 將其置于光強100 μmol/(m2·s), 光周期16 h/8 h(光/暗), 溫度28 ℃, 相對濕度80%的培養(yǎng)室中培養(yǎng).

1.3 種子萌發(fā)

水稻野生型和OsphyA突變體種子去殼、表面消毒后, 播種于MS培養(yǎng)基上, 4℃放置過夜. 次日將其移至黑暗或者光照(28℃ 遠(yuǎn)紅光)下培養(yǎng)3 d, 然后分析種子的萌發(fā)情況, 胚根和胚芽均長于1 mm 即視為萌發(fā).

1.4 OsPHYA基因的表達分析

取培養(yǎng)10 d的水稻幼苗根、莖和葉. 提取植物總RNA，并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA的第一鏈，以此鏈為模板，用Actin作內(nèi)參，通過半定量RT-PCR分析基因表達情況.

1.5 胚芽鞘測量

水稻野生型和OsphyA突變體種子去殼、表面消毒后，播種于MS培養(yǎng)基, 4℃放置過夜，再將其轉(zhuǎn)移到黑暗、連續(xù)紅光、脈沖紅光(光照強度為28 μmol/(m2·s)，脈沖時間3 min)、連續(xù)遠(yuǎn)紅光、脈沖遠(yuǎn)紅光(光照強度為2 μmol/(m2·s)，脈沖時間3 min)下培養(yǎng)10 d，分別測量水稻幼苗胚芽鞘長度. 每個處理至少測量15棵幼苗，實驗數(shù)據(jù)使用Excel 2003進行分析，每個實驗重復(fù)3次.

1.6 葉綠素含量測定

水稻野生型和OsphyA突變體種子各10粒，經(jīng)消毒后接種到MS培養(yǎng)基上，黑暗處理4 d，得到白化苗.白化苗經(jīng)過紅光的脈沖處理3 min，黑暗處理4 h，之后進行白光照射，時間做梯度處理：0、2、4、6 h，然后測葉綠素含量.

1.7 農(nóng)藝性狀的考查

成熟期從小區(qū)水稻田中隨機選取10株水稻植株，考查分蘗數(shù)、株高、穗長、每株穗數(shù)、每穗總粒數(shù)、結(jié)實率、千粒質(zhì)量等農(nóng)藝性狀,用Excel進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 OsPHYA基因的克隆及突變體鑒定

通過RT-PCR方法克隆了OsPHYA基因(圖1A)，其完整的ORF包括3 387個核苷酸，編碼1 129個氨基酸殘基，蛋白約125×103. 為進一步研究水稻OsphyA蛋白的功能，購買了Tos17插入突變體，利用“三引物法”對突變體進行純合體鑒定；通過水稻突變體庫得到Tos17上的邊界引物L(fēng)B，并且在Tos17插入位點的上下游100 bp處設(shè)計左端(LP)和右端(RP)引物，利用這3個引物做三引物PCR鑒定實驗. 野生型植株目的基因的2條染色體上均未發(fā)生Tos17插入，其PCR產(chǎn)物相對分子量即為LP到RP的大小；突變體純合植株目的基因的2條染色體上均發(fā)生Tos17插入，由于Tos17插入造成片段過長，普通PCR難于擴增，所以只能得到1種以LB與LP (或RP)為引物進行擴增的產(chǎn)物；鑒定結(jié)果表明(圖1B)，突變體NC2788和NC2793均為純合體植株.在此基礎(chǔ)上，對插入純合的突變體提取RNA進行RT-PCR，在RNA水平上鑒定Tos17插入是否抑制了OsPHYA基因的表達.結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖1 C)，NC2788株系沒有檢測到OsPHYA基因的表達，而NC2793株系檢測非常微量的表達.說明NC2788為基因完全缺失突變體，而NC2793突變體株系則為基因部分缺失突變體.

(1)PCR產(chǎn)物鑒定，M為分子標(biāo)準(zhǔn)；(B)突變體株系純合體的鑒定，1為LP+RP的擴增結(jié)果，2為LB+LP或RP的擴增結(jié)果；(C)RT-PCR鑒定.

圖1 水稻光敏色素A基因的克隆和鑒定

Figure 1 Cloning and mutant identification of rice phytochrome A

2.2 光、暗誘導(dǎo)下水稻光敏色素A基因的表達

研究正常生長狀態(tài)下基因的時空表達模式對預(yù)測基因的功能有著重要的作用.光敏色素A基因是參與光形態(tài)建成的主要光敏色素，受環(huán)境、發(fā)育以及特定組織的信號調(diào)節(jié)等影響.通過RT-PCR檢測了水稻植株在光暗條件下不同組織器官中OsPHYA的表達情況, 結(jié)果表明，在光照和黑暗條件下，OsPHYA在根、莖、葉中都有表達(圖2)，且在黑暗條件下的表達水平明顯高于光照條件.

圖2 光照、黑暗條件下水稻植株中OsPHYA的表達檢測

2.3 VLFR反應(yīng)條件下水稻種子的萌發(fā)

在擬南芥中，phyA調(diào)控VLFR反應(yīng)，在持續(xù)遠(yuǎn)紅光照射下促進種子萌發(fā).為了驗證水稻中phyA是否具有此功能，選取能夠引起VLFR反應(yīng)的3個梯度的FR輻照度(0.02、0.16、1.5 μmol/(m2·s))進行種子萌發(fā)實驗.

3個FR(遠(yuǎn)紅光)輻照梯度中，0.16 μmol/(m2·s)輻照度下野生型植株的萌發(fā)率和突變體植株相近，而在0.02、1.5 μmol/(m2·s)輻照度下，野生型植株的萌發(fā)率都要高于突變體植株；并且在1.5 μmol/(m2·s)的輻照度下，差異達到顯著水平.說明水稻phyA在FR介導(dǎo)的VLFR反應(yīng)中起作用，誘導(dǎo)水稻種子萌發(fā).而突變體植株中由于缺少了水稻phyA，萌發(fā)率普遍降低(圖3).

*號表示差異水平顯著

Figure 3 Seed germination rate of WT andOsphyAmutants under VLFR

2.4 VLFR和HIR反應(yīng)條件下水稻胚芽鞘的伸長

在單子葉植物中，胚芽鞘長度是反映不同光條件下光形態(tài)建成強弱的表型之一.作者驗證了持續(xù)紅光、遠(yuǎn)紅光或脈沖紅光、遠(yuǎn)紅光對野生型和突變體胚芽鞘伸長的影響.

不同光質(zhì)條件下野生型和phyA突變體的胚芽鞘長度存在差異. 從統(tǒng)計圖(圖4C)中表明，在黑暗條件下，野生型和突變體都展示了典型的胚芽鞘伸長的表型.在持續(xù)的紅光條件下，各個基因型的胚芽鞘長度都受到強烈抑制，長度基本一樣.而在持續(xù)的遠(yuǎn)紅光條件下，野生型的胚芽鞘長度明顯短于2個突變體株系.作者同時測定了VLFR條件下胚芽鞘的伸長，在PR條件下，各個基因型的胚芽鞘長度都受到抑制.而在PFR條件下，野生型的胚芽鞘長度明顯短于2個突變體株系.結(jié)果說明，水稻phyA感受遠(yuǎn)紅光信號，抑制水稻胚芽鞘的伸長.同時也說明水稻phyA不調(diào)節(jié)紅光反應(yīng).

D：dark 黑暗；pFR：pulse of far-red light 遠(yuǎn)紅光脈沖；cFR：continuous far-red light 持續(xù)遠(yuǎn)紅光；pR：pulse of red light 紅光脈沖；cR：continuous red light 持續(xù)紅光；bar=1 cm

圖4 不同光質(zhì)條件下野生型和OsphyA突變體胚芽鞘的伸長

Figure 4 Coleoptile elongation of WT andOsphyAmutants under different light conditions

2.5 水稻光敏色素A在白化苗轉(zhuǎn)綠實驗中的作用

葉綠素含量的積累是去黃化反應(yīng)的表現(xiàn)之一，黑暗生長的水稻幼苗表現(xiàn)出暗形態(tài)建成特征，如胚芽鞘長、缺少葉綠素和光調(diào)控基因表達受阻等；而光下生長的水稻幼苗表現(xiàn)出胚芽鞘受抑制、葉綠素合成和光調(diào)控基因表達被激活等光形態(tài)建成特征[16]. 為了確切了解OsPHYA基因是否參與水稻白化苗的去黃化過程, 測定了水稻白化苗轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素的含量變化(圖5).

隨著光照時間的增加，各基因型植株葉綠體含量呈上升趨勢(圖5)，而野生型植株的葉綠素含量增加幅度較快，在白光處理6 h與突變體株系達到了顯著差異.表明光敏色素A參與了水稻白化苗轉(zhuǎn)綠的過程，并在葉綠素合成的過程中起作用.水稻光敏色素A突變體因缺少PHYA基因，其葉綠素合成受到了影響.

2.6 水稻光敏色素A對水稻農(nóng)藝性狀的影響

圖5 野生型和OsphyA突變體在白化苗轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素質(zhì)量濃度的變化

Figure 5 Chlorophyll content change of WT andOsphyAmutants during de-etiolation

光敏色素基因是一類調(diào)控重要農(nóng)藝性狀的基因，有利于改良作物的株高、產(chǎn)量等有利性狀.研究表明，轉(zhuǎn)光敏色素基因的番茄、煙草和馬鈴薯均表現(xiàn)為植株降低、光合效率增強和產(chǎn)量提高[17].因此，作者從分蘗數(shù)、株高、穗長、每株穗數(shù)、每穗總粒數(shù)、結(jié)實率、千粒質(zhì)量等方面比較了水稻phyA突變體和野生型的差別，了解水稻phyA在農(nóng)藝性狀中的作用.

僅僅突變體株系2788在每株穗數(shù)這個農(nóng)藝指標(biāo)上與野生型存在顯著差異(表1)，而在分蘗數(shù)、株高、穗長、每穗總粒數(shù)、結(jié)實率、千粒質(zhì)量等幾個農(nóng)藝性狀方面，2個突變體株系和野生型差異不明顯.說明水稻光敏色素A在農(nóng)藝性狀方面所起作用不大，控制水稻產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀指標(biāo)是綜合因素的影響.

表1 水稻野生型與OsphyA突變體農(nóng)藝性狀的比較Table1 Comparison of agronomic traits in WT and OsphyA mutants

注： 同列中后附不同字母表示0.05 水平差異顯著性.

3 討論

光敏色素A為光不穩(wěn)定型，其基因的轉(zhuǎn)錄受不同光調(diào)控而表現(xiàn)為不同的模式[18]. 在黑暗中，通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的組合調(diào)節(jié)，表達水平能夠達到光條件下積累水平的100倍以上[19].研究發(fā)現(xiàn)黑暗條件下光敏色素A的表達水平明顯高于白光處理，與上述研究結(jié)果相吻合. 同時也驗證了光敏色素A在細(xì)胞質(zhì)中合成，見光后進入細(xì)胞核的過程其實是蛋白的一個降解過程[20].

種子萌發(fā)與否取決于種子內(nèi)的Pfr含量和Pfr/(Pr+Pfr)比值.Pfr/(Pr+Pfr)比值稱為光穩(wěn)定平衡值[21].一些植物種子需要特定的光穩(wěn)定平衡值才能萌發(fā)[21].究竟二者(Pfr絕對含量和Pfr/(Pr+Pfr)相對比值)中哪個是起關(guān)鍵的誘導(dǎo)作用？目前尚無統(tǒng)一的結(jié)論[22].總體上, 光敏色素促進種子萌發(fā)可以通過VLFR和LFR等2個反應(yīng)實現(xiàn).VLFR反應(yīng)受phyA調(diào)控, LFR則受到phyA以外光敏色素(phyB、phyC、phyD或phyE)的調(diào)控[23].作者發(fā)現(xiàn)，在遠(yuǎn)紅光1.5 μmol/(m2·s)條件下，缺少OsPHYA基因的突變體種子萌發(fā)率顯著低于野生型，說明OsphyA能夠在FR介導(dǎo)的VLFR反應(yīng)中促進水稻種子萌發(fā). 然而OsphyA只是促進水稻種子萌發(fā)的條件之一，要進一步認(rèn)識水稻種子內(nèi)光敏色素調(diào)控種子萌發(fā)的生理反應(yīng)模式，還應(yīng)考慮到許多其他相關(guān)的影響因素(如OsphyB、植物激素等).

水稻胚芽鞘生長是一個重要的光形態(tài)建成特征，這個特征受到OsphyA、OsphyB和OsphyC的調(diào)節(jié).在本實驗中，野生型和OsphyA突變體植株在持續(xù)遠(yuǎn)紅光或者遠(yuǎn)紅光脈沖條件下都表現(xiàn)出一定程度的胚芽鞘抑制現(xiàn)象，說明OsphyA在遠(yuǎn)紅光條件下，參與了抑制胚芽鞘伸長的反應(yīng).黑暗條件下，由于光形態(tài)的缺失，不管是野生型還是突變體，都表現(xiàn)出黃化苗的特征.當(dāng)紅光持續(xù)照射時，各個基因型的胚芽鞘長度都受到強烈抑制，長度基本一樣，說明OsphyA不調(diào)節(jié)紅光反應(yīng). 雖然遠(yuǎn)紅光抑制單子葉胚芽鞘的伸長和抑制雙子葉下胚軸的伸長都是抑制細(xì)胞的伸長所產(chǎn)生，但單子葉植物擬南芥和雙子葉植物水稻之間還是存在著區(qū)別.前者是VLFR起主要介導(dǎo)作用，而后者主要是HIR起作用[15].

農(nóng)藝性狀是衡量水稻各方面產(chǎn)量的綜合指標(biāo)，Kong等[24]發(fā)現(xiàn)在水稻中，利用植物在光照條件下特異表達的RBCS基因的啟動子，過量表達擬南芥的光敏色素A基因，轉(zhuǎn)基因植株會出現(xiàn)植株變矮、谷粒增大、葉綠素含量增高等性狀. Iwamoto等[25]研究表明，光敏色素A在水稻幼苗光形態(tài)建成方面起重大的作用，但對于成熟水稻的影響則相對較弱. 顧建偉等[5]通過比較水稻野生型和所有光敏色素突變體的生長發(fā)育特征，發(fā)現(xiàn)3個光敏色素在水稻生長發(fā)育中具有重疊或特異的調(diào)控作用. 在本實驗中檢測了水稻的7個典型的農(nóng)藝性狀. 結(jié)果顯示，自然光照條件下水稻phyA突變體和野生型的農(nóng)藝性狀沒有明顯的差異，說明水稻光敏色素A的缺失不會對水稻的產(chǎn)量造成影響. 水稻農(nóng)藝性狀是復(fù)雜的多層次基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果，同時環(huán)境脅迫也起著很重要的作用.

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