花生廢棄物中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的提取與分析

韓寒冰， 沈 蘭， 李海航*

(1.廣東石油化工學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，茂名 525000；2.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510631)

白藜蘆醇，化學(xué)名為3,4′,5-三羥基二苯乙烯，白藜蘆醇苷是白藜蘆醇的葡萄糖苷.白藜蘆醇是植物體內(nèi)抵抗病原菌侵染的一類重要的植物抗毒素，具有顯著的抗癌抑癌、心血管保護(hù)、抗氧化和清除自由基等藥理作用[1-2].研究表明，白藜蘆醇通過抗氧化、抗突變、抑制環(huán)加氧酶和氫過氧化物酶的活性、誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化等作用，抑制癌細(xì)胞生長、增殖和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[3-4]，白藜蘆醇苷在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成白藜蘆醇，并發(fā)揮同樣的功效.白藜蘆醇主要存在于虎杖、葡萄和花生中，虎杖的含量最高[5].虎杖作為名貴的中藥材，提取白藜蘆醇和白藜蘆醇苷成本太高.研究發(fā)現(xiàn)，在花生的根、莖中含有白藜蘆醇[6-8]，但從花生中提取、分析白藜蘆醇苷的方法尚未見報(bào)道.

花生收獲種子后，植株被丟棄在田間，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染.本研究對花生各廢棄物提取的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷，進(jìn)行定性和定量分析，為花生廢棄物資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

供試花生(Arachishypogaea)品種珍珠紅14、粵油114、汕油523和湛油75，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花生研究室提供.2012年7月采收的花生，洗凈后，取根、莖、葉和殼于50 ℃烘箱烘干，粉碎后過0.425 mm篩，備用.

甲醇(色譜純)，超純水，乙醇(95%食用級)，白藜蘆醇和白藜蘆醇苷對照品(購于成都曼思特生物科技有限公司，純度≥98%).

1.2 樣品的提取

樣品的提取采用溶劑浸泡提取法[6].精密稱取1 g樣品干粉于15 mL提取管中，加入10 mL不同體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%、80%、90%)的乙醇水溶液，在60 ℃水浴中超聲浸提1 h，2 500 r/min離心5 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm膜過濾后，用高效液相色譜進(jìn)行定性和定量分析.

分析提取次數(shù)對提取效果的影響時，按以上同樣的方法提取和分析.第一次提取用10倍體積(w/v)的提取溶劑，此后每次用5倍體積的提取溶劑提取，樣品中白藜蘆醇及其苷的定量分析用1 g材料加10倍體積(w/v)的提取溶劑提取1次，再用5倍體積的提取溶劑提取2次合并3次提取液，HPLC分析.

每個樣品的定量分析至少重復(fù)3次，取平均值計(jì)算結(jié)果，并計(jì)算重復(fù)之間的標(biāo)準(zhǔn)差.

1.3 白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的定性和定量分析

用島津公司的SPD-20A高效液相色譜儀(HPLC)采用HPLC法分析提取液白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量.HPLC條件為：LC-20AT 紫外檢測器，檢測波長為303 nm；色譜柱為依利特ODS1柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)柱，柱溫35 ℃；流動相為甲醇:超純水(30∶70,v/v)，流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL.

定性分析通過HPLC的保留時間和樣品與對照品相加實(shí)驗(yàn).定量分析用不同質(zhì)量濃度(5、10、15、20、25、30 μg/mL)的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷對照品溶液制作濃度與峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品峰的面積計(jì)算成分的含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 花生廢棄物提取液中白藜蘆醇及白藜蘆醇苷的鑒定

圖1A為白藜蘆醇和白藜蘆醇苷對照品的HPLC圖譜，峰1和峰2分別為白藜蘆醇苷和白藜蘆醇.花生提取液樣品的HPLC圖譜(B)中，在與對照品相應(yīng)的保留時間處同樣出現(xiàn)2個峰.且在樣品與對照品相加試驗(yàn)(C)中，對應(yīng)的2個峰面積接近對照品和樣品的峰面積之和，而圖譜中其余的峰值基本一樣.鑒定樣品中1和2號峰分別為白藜蘆醇苷和白藜蘆醇.

(A)白藜蘆醇苷(1)和白藜蘆醇(2)的對照品混合液；(B)花生根提取物；(C)對照品與花生根提取物的混合液

圖1 花生根提取液中白藜蘆醇苷和白藜蘆醇的HPLC鑒定

Figure 1 HPLC identification of polydatin and resveratrol in peanut extracts

2.2 白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線和精密度

將不同質(zhì)量濃度的白藜蘆醇及白藜蘆醇苷對照品溶液HPLC檢測，得到2種物質(zhì)的質(zhì)量濃度與峰面積關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2).白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=22 074x+5 546.3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6(圖2A).白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=13 739x+2 867.7，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9(圖2B).表明2種物質(zhì)在5～30 μg/mL的范圍內(nèi)溶液質(zhì)量濃度與峰面積之間有良好的線性關(guān)系.

用10 μg/mL白藜蘆醇和白藜蘆醇苷對照溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，測得峰面積之間的RSD分別為1.2%和1.6%，表明HPLC儀器及進(jìn)樣精密度良好.

圖2 白藜蘆醇(A)和白藜蘆醇苷(B)的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 從花生廢棄物中提取白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的影響因素

乙醇體積分?jǐn)?shù)對珍珠紅14的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷提取率的影響(圖3).結(jié)果表明，60%乙醇對白藜蘆醇的提取率最高，50%乙醇對白藜蘆醇苷的提取率最高.當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過60%時，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，2種化合物的提取率都有所降低.由于白藜蘆醇苷在50%和60%乙醇時的提取率差異不大，選擇60%乙醇作為提取液，可同時提取2種成分，提取率較高.

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對花生莖白藜蘆醇和白藜蘆醇苷提取量的影響

Figure 3 Effect of different concentrations of ethanol on the extraction amount of resveratrol and polydatin from peanut stem

以60%的乙醇為提取溶劑，提取珍珠紅14的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷，第1次提取按料液比1∶10，第2次及以后按料液比1∶5，60 ℃下超聲波提取4次，HPLC分別測定各次提取液中白藜蘆醇及白藜蘆醇苷含量(圖4).第4次提取液中2種成分均未檢測到.說明前3次提取可將花生材料中的白藜蘆醇及其苷全部提取出來，因此，定量分析花生材料中白藜蘆醇及白藜蘆醇苷的條件為用60%的乙醇、60 ℃下超聲提取3次(每次1 h)，第1次按料液比1∶10，第2、3次按料液比1:5，合并3次提取液，HPLC測定提取液中白藜蘆醇及白藜蘆醇苷含量的結(jié)果表明，以第1次提取的含量最高.

圖4 提取次數(shù)對花生莖中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷提取量的影響

Figure 4 Effect of extraction times on extraction amount of resveratrol and polydatin from peanut stem

不同花生品種中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量差異很大(表1).4個花生品種中，白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量在珍珠紅14中各器官中偏高，湛油75號中偏低；珍珠紅14的根中2種化合物的含量分別為148.7、133.7 μg/g，與湛油75的根中的含量分別相差2.76和2.42倍.

同一品種花生的不同器官中2種化合物的含量也都有很大的差別，依次均為根>莖>葉>殼.如珍珠紅14中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量在根中分別為148.7、133.7 μg/g，和果殼中的含量分別相差15.8倍和11.6倍.此外，白藜蘆醇和白藜蘆醇苷含量在不同品種和不同器官中有類似的分布，即含量高的品種和器官中2種化合物的含量都高，反之，含量低的品種和器官中2種化合物的含量都低，且同一材料中2種化合物的含量比較接近.

表1 花生各器官中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量Table 1 Resveratrol and polydatin contents in different peanut organs μg/g

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,n=3.

3 討論

研究從花生中提取白藜蘆醇含量測定方法比較多[7-8]，但對花生生產(chǎn)中的各種廢棄物中提取白藜蘆醇苷未見報(bào)道.目前，研究白藜蘆醇苷提取的材料是虎杖[9-10]和葡萄[11-13].同時提取和測定白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的研究也主要集中在虎杖、葡萄、葡萄酒和桑椹[14-16].Sales等[17]研究紫外光和超聲波提高花生仁白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量，在最優(yōu)條件下，白藜蘆醇含量為2.64～4.40 μg/g，總芪類的含量為4.50～6.50 μg/g，但文中并沒有明確白藜蘆醇苷的含量.本文同時對花生各種廢棄物中的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷進(jìn)行了定性和定量分析，顯示白藜蘆醇和白藜蘆醇苷都同時存在于花生的根、莖、葉和種殼中，且二者的含量比較接近.研究表明花生不同品種和不同器官中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量有很大的差異.不同品種的4種器官中都以根中含量最高.珍珠紅花生根中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷含量分別達(dá)到148.7、133.7 μg/g，比葡萄和桑椹等材料中的高得多.據(jù)統(tǒng)計(jì)，2010 年世界花生種植面積、總產(chǎn)量分別為2 120 萬hm2和3 511萬t，中國種植面積、總產(chǎn)量分別為440萬hm2和1 520萬t[18].花生種植和加工業(yè)產(chǎn)生大量的根、莖、葉和殼廢棄物，研究花生根、莖、葉和殼等廢棄物中的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷，對綜合開發(fā)利用花生廢棄物和提高花生產(chǎn)業(yè)的附加值有重要的意義.

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