光譜法研究卟啉-蒽醌化合物及其金屬鋅配合物與DNA的相互作用

趙勝芳,陳年友,張梁,嚴(yán)定策

(1.黃岡師范學(xué)院化工學(xué)院,湖北 黃岡 438000;2.武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院,湖北 武漢 430072)

光譜法研究卟啉-蒽醌化合物及其金屬鋅配合物與DNA的相互作用

趙勝芳1,陳年友1,張梁2,嚴(yán)定策2

(1.黃岡師范學(xué)院化工學(xué)院,湖北 黃岡 438000;2.武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院,湖北 武漢 430072)

用光譜法研究以二肽鏈連接的卟啉-蒽醌化合物及其金屬鋅配合物與DNA的相互作用.結(jié)果表明:卟啉-蒽醌化合物及其金屬鋅配合物與DNA發(fā)生外部結(jié)合.由紫外-可見光譜滴定數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合計(jì)算出卟啉-蒽醌化合物及其金屬鋅配合物與DNA相互作用的結(jié)合常數(shù)分別為2.2×105(mol/L)-1和6.7×105(mol/L)-1.

卟啉-蒽醌;金屬卟啉;DNA;相互作用;光譜法

卟啉化合物具有大的平面共軛結(jié)構(gòu),其在400～500 nm處有強(qiáng)的吸收帶,摩爾吸收系數(shù)一般在(2～5)×105L·(cm·mol)-1,當(dāng)卟啉與其他化合物發(fā)生相互作用時(shí),其電子吸收光譜會(huì)發(fā)生規(guī)律性變化,故可以通過紫外-可見光譜的變化檢測(cè)卟啉與客體的結(jié)合情況.

脫氧核糖核酸是生命體內(nèi)重要的生物大分子,是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ),與生命的延續(xù)、生物的生長發(fā)育、細(xì)胞分化等正常的生命活動(dòng)密切相關(guān),核酸異常可能導(dǎo)致腫瘤、遺傳病、代謝病等,因此,核酸也作為作為抗癌、抗病毒等藥物作用的靶點(diǎn).

卟啉化合物由于其獨(dú)特的生物特性和光學(xué)性能,被作為光敏劑,用于癌癥、心血管等疾病的光動(dòng)力療法[1-4].蒽醌類化合物能夠插入DNA螺旋分子中相鄰單元,阻礙DNA在DNA及RNA復(fù)制中的模板作用,對(duì)DNA產(chǎn)生有效的光切割[5].因此,將蒽醌引入卟啉中形成卟啉-蒽醌體系,通過卟啉產(chǎn)生單線態(tài)氧及蒽醌對(duì)DNA分子的光切割作用,對(duì)病變細(xì)胞產(chǎn)生雙重殺傷,可能作為一種新型靶向光敏藥物.

本文中用光譜法研究以二肽鏈連接的卟啉-蒽醌化合物及其金屬鋅配合物與DNA的相互作用,結(jié)果表明:卟啉-蒽醌化合物及其金屬鋅配合物與DNA發(fā)生自堆積的外部鍵合.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1實(shí)驗(yàn)儀器紫外可見光分光光度計(jì)(Lambda 10UV/vis spectrometer,美國Perkin-Elmer公司),RF-5301型熒光光譜儀(日本,津島公司),CHI660C電化學(xué)工作站(上海晨華).

1.2實(shí)驗(yàn)試劑DMF、DMSO和CHCl3為分析純,精制后使用;鮭魚精DNA(生化試劑,);其余試劑均為化學(xué)純或分析純.石英亞沸二次蒸餾水.卟啉-蒽醌化合物(A)及其金屬鋅配合物(B)按文獻(xiàn)[6]方法制備,高氯酸四丁基銨(TBAP)按文獻(xiàn)[7]制備.

1.3A、B與DNA作用的光譜法研究

1.3.1 溶液的配制 緩沖溶液的配制:配制含有5 mmol/L Tris和50 mmol/L NaCl的溶液,用鹽酸調(diào)節(jié)溶液酸度使pH=7.2.化合物與DNA相互作用的紫外-可見吸收光譜、熒光光譜均在此緩沖溶液中進(jìn)行.

DNA溶液的配制:稱取適量的鮭魚精DNA溶解于Tris緩沖溶液中,抽濾,濾液按需要稀釋到一定濃度.測(cè)定DNA溶液在260 nm和280 nm處的吸光度,A260/A280=1.8～1.9,說明溶液中基本不含蛋白質(zhì),不需要進(jìn)一步處理.鮭魚精DNA的濃度以堿基對(duì)的濃度計(jì),測(cè)定DNA在260 nm處的吸光度,根據(jù)DNA在260 nm處的摩爾吸光系數(shù)值6 600(mol/L)-1cm-1來確定DNA的濃度.配制的DNA溶液濃度4.29×10-5mol·L-1,放置在冰箱中,4 ℃下保存?zhèn)溆?

主體卟啉-蒽醌化合物A及其金屬鋅配合物B溶液的配制:卟啉化合物用少量DMSO溶解,Tris緩沖溶液稀釋(DMSO的濃度應(yīng)小于5%),配成濃度為3×10-5mol·L-1溶液備用.

1.3.2 紫外-可見吸收光譜滴定 在參比池中加入2.5 mL Tris-HCl緩沖溶液,樣品池中加入同樣體積的3×10-5mol·L-1的A或B溶液.用微量注射器每次向參比池和樣品池中加入1 μL的DNA儲(chǔ)備液,使DNA與A或B的濃度比值不斷增加,直至飽和.每次混合均勻約5 min后,在200～800 nm范圍內(nèi)檢測(cè)A和B的紫外-可見吸收光譜的變化.

1.3.3 穩(wěn)態(tài)熒光光譜滴定 熒光光譜滴定參照紫外-可見吸收光譜滴定操作方法,以420 nm為激發(fā)波長,狹縫寬度5/5 nm,觀察熒光發(fā)射光譜的變化.

2 結(jié)果與討論

2.1A、B與DNA作用的紫外-可見吸收光譜紫外-可見吸收光譜是研究小分子化合物與DNA相互作用的最常用方法之一.通常,化合物與DNA結(jié)合后會(huì)導(dǎo)致化合物所處的環(huán)境發(fā)生改變,結(jié)合強(qiáng)弱可通過光譜擾動(dòng)的變化反映出來.DNA加入到卟啉溶液后Soret帶都會(huì)出現(xiàn)一定程度的減色和紅移,減色大于30%,紅移超過10 nm是插入模式的明顯標(biāo)志.當(dāng)卟啉對(duì)DNA表現(xiàn)為溝外結(jié)合模式時(shí),其紫外-可見光譜基本不變或者變化較小[8].

DNA加入后卟啉-蒽醌化合物A和卟啉-蒽醌金屬鋅配合物B的紫外-可見吸收光譜變化見圖1.從圖譜可見,隨著DNA濃度的增加,A和B的Soret帶都發(fā)生一定減色和較小紅移,同時(shí)卟啉-蒽醌的Q1帶發(fā)生輕微增色效應(yīng),并且A和B分別在478 nm處和482 nm處有等吸收點(diǎn)產(chǎn)生.圖譜變化說明DNA與卟啉-蒽醌發(fā)生了相互作用,其光譜變化程度顯示A、B與DNA發(fā)生的是表面吸附作用.

A、B與DNA相互作用的強(qiáng)弱可以通過結(jié)合常數(shù)Kb的大小加以說明,根據(jù)下面的公式[9]求出化合物與DNA的Kb:

[DNA]/(εa-εf)=[DNA]/(εb-εf)+1/[Kb(εb-εf)].

式中[DNA]表示DNA的濃度,εa,εf,εb分別代表,Aobsd/[Hybrid]、主體卟啉-蒽醌化合物未結(jié)合DNA的摩爾吸光系數(shù)和與DNA完全結(jié)合后的摩爾吸光系數(shù).以[DNA]/(εa-εf)對(duì)[DNA]作圖,可要求出結(jié)合常數(shù)Kb.由此計(jì)算得到A和B與DNA的結(jié)合常數(shù)分別是2.2×105(mol/L)-1,6.7×105(mol/L)-1,擬合結(jié)果見表1.可以看到B與DNA的結(jié)合常數(shù)大于A與DNA的,這可能是由于化合物B中金屬離子Zn帶一定量的正電荷,與DNA分子中帶負(fù)電荷的磷酸酯基存在著較大的靜電吸引所致.

圖1 A、B與DNA作用的紫外-可見光譜圖

A、B溶液(a)的原始濃度均為3×10-5mol/L,b→h:每次向a中加入1 μL 4.29×10-5mol/L DNA溶液

2.2A、B與DNA作用的熒光光譜卟啉及其大部分金屬配合物都有較好的熒光發(fā)射光譜,卟啉-蒽醌化合物與DNA結(jié)合后,熒光光譜將發(fā)生變化,光譜變化幅度的大小反映了化合物與DNA作用的強(qiáng)弱及與DNA作用的方式.當(dāng)卟啉-蒽醌化合物與DNA作用后,其熒光光譜也會(huì)出現(xiàn)增色或減色效應(yīng),當(dāng)卟啉-蒽醌化合物與DNA以插入模式結(jié)合時(shí),熒光光譜會(huì)出現(xiàn)明顯的變化;當(dāng)它以溝外連接或外部堆積模式與DNA結(jié)合時(shí),其熒光光譜變化很小甚至不發(fā)生變化[8].

表1 卟啉化合物A、B與DNA作用的線性擬合數(shù)據(jù)

卟啉-蒽醌化合物A及其金屬鋅配合物B與DNA相互作用的熒光光譜滴定曲線見圖2.從圖中可以看出,在Tris緩沖溶液中,A和B的最大熒光發(fā)射峰約在500 nm左右,隨著DNA的加入,卟啉化合物A和B的熒光強(qiáng)度逐漸減小.根據(jù)文獻(xiàn),如果化合物插入到DNA堿基對(duì)中,由于化合物分子受到DNA分子的屏蔽,減少了與溶劑分子的碰撞,從而使熒光增強(qiáng);相反,如果化合物不能插入DNA,分子之間的作用就會(huì)降低化合物的熒光強(qiáng)度.后一種情況,表明分子與DNA可能是以外部結(jié)合模式作用[10].由于熒光發(fā)射光譜是卟啉環(huán)產(chǎn)生的,由此可推知,A和B的卟啉環(huán)與DNA均是以表面吸附發(fā)生作用的.

圖2 A、B與DNA作用的熒光光譜圖

A、B溶液(a)的原始濃度均為3×10-5mol/L,b→h:每次向a中加入1 μL 4.29×10-5mol/L DNA溶液

3 結(jié)論

以二肽鏈連接的卟啉-蒽醌化合物及其金屬鋅配合物與DNA的紫外-可見光譜滴定以及穩(wěn)態(tài)熒光光譜滴定證明:卟啉-蒽醌化合物及其金屬鋅配合物與DNA有較強(qiáng)的相互作用.其作用模式為外部結(jié)合.根據(jù)光譜方法計(jì)算出化合物A、B與DNA的結(jié)合常數(shù)分別是2.2×105,6.7×105(mol/L)-1.其作用的詳細(xì)機(jī)理還需要進(jìn)一步確證.

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(責(zé)任編輯 胡小洋)

Interactionofporphyrin-anthraquinoneanditszinccomplexwithDNAinvestigatedbyspectroscopymethod

ZHAO Shengfang1,CHEN Nianyou1,ZHANG Liang2,YAN Dingce2

(1.School of Chemical Engineering, Huanggang Normal University, Huanggang 438000, China;2. School of Chemistry and Molecular Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, China)

The interaction of porphyrin-anthraquinone hybrid with dipeptide link and its metal complex with DNA was investigated by means of UV-Vis absorption and fluorescence spectroscopy. The result suggest that the mode of the interaction of porphyrin-anthraquinone and its zinc complex may be outside groove-face binding with DNA. The binding constants of porphyrin-anthraquinone and its zinc complex with DNA determined by UV-Vis spectra titration were 2.2×105(mol/L)-1and 6.7×105(mol/L)-1, respectively.

porphyrin-anthraquinone; metal porphyrin; DNA; interaction; spectra titration

2013-11-25

湖北省自然科學(xué)基金(2007ABA064)資助

趙勝芳(1956-),女,教授,E-mail:zhshfang@hgnu.edu.cn;陳年友,通信作者,教授,E-mail:chennyou@hgpu.edu.cn

1000-2375(2014)05-0443-04

Q523

A

10.3969/j.issn.1000-2375.2014.05.011