葡萄(Vitis vinifera L.)籽蛋白的生化組成分析

汪 瑩，胡 冰，徐丹娜，馬慧麗，賴童飛，周 婷

(杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，浙江 杭州 310036)

葡萄(Vitisvinifera)是葡萄屬一種常見落葉木質藤本植物，果實為漿果類水果.葡萄籽為葡萄的種子，質量約占整粒葡萄的5%～7%，是葡萄酒廠和飲料廠在榨汁過程中的主要副產(chǎn)品.我國是葡萄生產(chǎn)大國，2012年產(chǎn)量達960萬噸(http://faostat.fao.org/)，可產(chǎn)生至少20～30萬噸的葡萄籽.葡萄籽含有豐富的蛋白質、粗脂肪、各種氨基酸、維生素及礦物質等[1]，具有一定的營養(yǎng)及藥用價值.但國內(nèi)尚未對葡萄籽進行良好的加工利用，分離后多丟棄或發(fā)酵后用做肥料，造成了資源的浪費.

目前，對于葡萄籽的開發(fā)主要集中于榨油(葡萄籽油中富含人體必需且自身不能合成的亞油酸)及提取其中的天然抗氧化成分低聚原花青素(Oligomeric proanthocyanidins, OPC).近年來，研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽及其衍生物具有更多的用途.Adámez等研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽提取物對格蘭仕陽性菌及陰性菌均有明顯的抑制作用[2]；Su等發(fā)現(xiàn)葡萄籽提取物能夠控制HAV、FCV-F9、MNV-1的3種食源性病毒引發(fā)的病害[3]；Afonso等研究表明葡萄籽中的酚類復合物能夠抑制Angiotensin I converting enzyme的活性，可用于治療心血管疾病[4]；同時，葡萄籽提取物對風濕性關節(jié)炎[5]、鎘誘導的腎損傷[6]、膀胱癌[7]有一定的療效.此外，Reddy等將葡萄籽提取物用于羊肉切片及銀鯉的冷藏保鮮[8-9]；Okaman等還通過化學活化途徑將葡萄籽制成活性炭[10].但是長期以來，對葡萄籽的重要組分蛋白質(約占總重的8.44%～25.9%)關注度較低，早期主要集中于葡萄籽蛋白的分離提取技術[11-12]，近年來，Pesavento等利用MALDI-MS分析了不同栽培品種葡萄籽蛋白的區(qū)別，但沒有鑒定具體的成分[13]；Gazzola等利用LC-MS/MS技術發(fā)現(xiàn)葡萄籽胚乳蛋白主要成分與植物種子蛋白11S globulin同源，并鑒定出一種分子量為43 kDa且與豆科種子7S globulins高度同源的蛋白[14].葡萄籽蛋白的營養(yǎng)學價值及應用潛力需要進一步挖掘.

因此，本研究主要通過雙向電泳結合質譜鑒定技術、氨基酸含量分析以及紅外光譜分析技術，初步研究了葡萄籽蛋白的主要成分及生化特性，為葡萄籽的綜合利用和深度開發(fā)提供了理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

葡萄(VitisviniferaL.)籽分離自葡萄皮渣，干燥后用于后續(xù)試驗，由天津尖峰天然產(chǎn)物研究發(fā)展有限公司提供.大豆分離蛋白(蛋白含量為85%)，購自哈爾濱大豆高新科技有限公司.

1.2 葡萄籽化學成分分析

葡萄籽的各項生化指標檢測簡述如下，水分的測定參見GB/T 5009.3-03：直接干燥法；灰分的測定參見GB/T 5009.4-03：干法灰化；脂肪的測定參見GB/T 5009.6-03：索氏抽提；蛋白質含量的測定參見GB/T 5009.5-03：微量凱氏定氮法.

使用IRIS Intrepid型電感耦合全譜直讀等離子發(fā)射光譜儀(Thermo，USA)，檢測葡萄籽金屬含量.準確稱取葡萄籽粉末0.5 g，放入聚四氟乙烯消解罐中.消解罐中加入10 mL王水(V(HCl) ∶V(HNO3)=3∶1)，100 ℃加熱2 h，冷卻到室溫后向消解罐中加入3 mL HNO3，100 ℃加熱2 h，冷卻到室溫再加入1 mL HNO3，120 ℃加熱4 h，冷卻靜置過夜.用超純水定容至50 mL.ICP-AES法測定，射頻功率1 050 kW，霧化氣壓力為4.25×106Pa，輔助氣流速110 L/min，樣品提升量1 170 mL/min，樣品沖洗時間1 min，高波掃描5 s，低波掃描30 s.

1.3 葡萄籽蛋白提取及雙向電泳分析

將100 g葡萄籽粉碎、勻漿(50 mmol/L PBS +1%(w/v)PVP，pH 7.5，料液比例為1 g∶4 mL)，8層紗布過濾后，4 ℃、12 000 g、30 min離心保留上清液，超純水透析，100 kDa超濾膜濃縮，冷凍干燥，蛋白干粉樣品-80 ℃保存?zhèn)溆?

按10 μg∶1 μL比例將蛋白干粉溶解于蛋白裂解緩沖液(2 mol/L thiourea，7 mol/L urea，4%(w/v)CHAPS，1%(w/v)DTT，2%(v/v)carrier ampholytes pH 3-10)Bradford法檢測蛋白質濃度.取100 μg蛋白樣品利用裂解緩沖液定容至125 μL，20 ℃水化IPG膠條(IPG strip pH3-10 NL，7 cm)15 h.在等電聚焦儀(PROTEAN i12 IEF Cell，Bio-Rad，USA)中進行等電聚焦.運行參數(shù)：250 V Rapid 15 min；4000 V Gradual 60 min；4000 V Rapid 15 000 Vhr；500 V Hold.等電聚焦完畢后，在10 mL平衡緩沖液(6 mol/L urea，75 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)，29.3%(v/v)glycerol，2%(w/v)SDS，0.002%(w/v)bromophenol blue)中平衡2次，每次15 min.第一次平衡液中加入100 mg二硫蘇糖醇，第二次平衡液中加入250 mg碘乙酰胺.使用Mini-PROTEAN Tetra Cell(Bio-Rad，USA)垂直電泳儀進行第二向SDS-PAGE電泳.分離膠濃度為12.5%，濃縮膠濃度為5%.電壓設定為120 V，電泳1.5 h.考馬斯亮藍G-250染色.利用凝膠掃描儀ChemiDoc XRS+ Imaging System(Bio-Rad，USA)采集圖像，掃描模式為Transmission mode，分辨率為600 dpi，保存為TIF格式的圖像文件.運用Image Master 2D Elite software(Amersham Pharmacia Biotech，Sweden)軟件進行分析.挑選豐度最高的5個蛋白點送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行質譜鑒定，使用儀器為MALDI-TOF-TOF-MS ABI 4800串聯(lián)質譜(ABI，USA)，檢測結果利用MASCOT搜索引擎(Matrix Science Ltd., London，UK)進行搜索.MASCOT MS/MS Ions搜索參數(shù)的設置為：Enzyme：Trypsin；Fixed modifications：Carbamidomethyl(C)；Variable modifications：Acetyl(Protein N-term)，Deamidated (NQ)，Dioxidation(W)，Oxidation(M)；Mass values：Monoisotopic；Peptide Mass Tolerance：±100 ppm；Fragment Mass Tolerance：±0.3 Da；Max Missed Cleavages：1；Instrument type：MALDI-TOF-TOF.

1.4 葡萄籽蛋白的氨基酸組成分析

樣品用含2%(w/v)苯酚的6 mol/L鹽酸混合，充N2，熔封，置110 ℃水解20 h.旋轉蒸發(fā)至干，加硼砂緩沖液溶解，OPA/FMOC柱前自動衍生化后上樣分析[15].分析柱：hypersil ODS柱 5 μm 4.0×125 mm(Thermo，USA)；流動相A：20 mmol/L NaAc(pH7.6)，含0.018%(v/v)三乙胺(TEA)和0.3%(v/v)四氫呋喃(THF)；流動相B：100 mmol/L NaAc(pH7.2)、CH3OH及CH3CN的混合物，3種物質體積比為1︰2︰2；流速：1 mL/min；柱溫：40 ℃；DAD UV檢測器： Signal A=338/10 nm Ref =390/20 nm，Signal B=262/16 nm Ref=324/8 nm.

1.5 葡萄籽蛋白紅外光譜測定

將干燥的2 mg蛋白樣品與200 mg溴化鉀研磨均勻，置于模具中，用5×107Pa壓力在油壓機上壓成透明薄片，采用Nicolet Magna IR 560傅里葉變換紅外光譜儀(Thermo Nicolet，USA)在4000～400 cm-1波數(shù)范圍測定吸收光譜[16].掃描次數(shù)128次，分辨率4 cm-1.

2 實驗結果

2.1 葡萄籽化學成分組成

表1葡萄籽主要成分及金屬元素含量

Tab.1Themaincomponentsandmetalelementscontentofgrapeseeds

主要成分/%金屬元素/(g/kg)金屬元素/(mg/kg)蛋白質9.57±1.77鈣4.536±0.171鐵54.281±7.067水分 36.62±2.14鎂0.753±0.036鋅11.243±1.694灰分 3.11±0.25鉀1.372±0.085砷 0.469±0.018油脂 13.56±1.18磷2.287±0.114鎘 0.049±0.004

葡萄籽中蛋白質含量豐富，約占總重的1/10，同時水分及油脂含量超過了50%(表1).因此，葡萄籽經(jīng)過榨油等工藝后，籽粕中蛋白質含量會進一步提高.同時，葡萄籽中富含鈣、磷、鉀及鎂，砷含量低于糧食國家限量標準(0.7 mg/kg)及重金屬鎘含量低于谷物類歐盟限量標準(0.1 mg/kg)(表1).在原料產(chǎn)量及食品安全性方面為葡萄籽蛋白的開發(fā)及應用提供了保障.

2.2 葡萄籽高豐度蛋白鑒定

圖1 葡萄籽蛋白雙向電泳凝膠圖譜

利用雙向電泳分離葡萄籽總蛋白(圖1)，蛋白點主要分布在15～50 kDa之間，酸性端(正極)及堿性端(負極)均有分布，通過Image Master 2D Elite software軟件識別分析，總數(shù)在30～40之間.蛋白點較少的原因可能是因為葡萄籽中高含量的多酚物質及油脂干擾，導致疏水性蛋白質的丟失.同時也可能因為葡萄籽中主要蛋白含量過高，導致凝膠背景較深，影響了軟件對低豐度蛋白的識別.選擇豐度最高的5個蛋白點進行串聯(lián)質譜鑒定.鑒定結果(表2)通過數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，5個蛋白點的Mascot值均超過閾值，同屬于Vitisvinifera，肽段匹配數(shù)至少為9個，序列覆蓋率超過20%.盡管實際分子量和等電點有所不同，但蛋白點S1和S3的鑒定結果均指向11S globulin subunit beta-like isoform 1，蛋白點S2、S4和S5鑒定結果均指向legumin A-like isoform 1，不同蛋白點鑒定為同一蛋白的現(xiàn)象可能與該蛋白質的結構變化、亞基組成或翻譯后修飾有關.11S globulin subunit beta是一個種子貯藏蛋白，由一個11S globulin gamma chains 和11S globulin Delta chains通過一個二硫鍵形成，該蛋白是一個鎂離子結合蛋白，翻譯后修飾是通過N末端谷氨酰胺的環(huán)化完成.其功能主要是提供鎂離子結合位點，同時具有營養(yǎng)貯藏功能，這與Zhou等的研究結果[17]是一致的.Legumin A也是屬于11S種子貯藏蛋白，同樣由Legumin A alpha chain 和Legumin A beta chain通過一個二硫鍵形成.該蛋白存在于許多豆科或非豆科植物種子中，作為膳食可提供豐富的含硫氨基酸，其主要功能也是貯藏營養(yǎng)(http://www.uniprot.org).因此可以推斷，葡萄籽蛋白主要由11S球蛋白構成，其主要功能為營養(yǎng)貯藏.

表2 葡萄籽高豐度蛋白質譜鑒定結果

b為匹配蛋白的理論分子量及理論等電點;

c括號外為與蛋白匹配上的肽段數(shù)量，括號內(nèi)為分值超過閾值的肽段數(shù)量;

d肽段在匹配蛋白總序列中的覆蓋率.

2.3 葡萄籽蛋白的氨基酸組成

葡萄籽蛋白中氨基酸的組成與其他很多植物種子11S球蛋白的氨基酸組成相近(表3)，與大豆分離蛋白中含量相似的氨基酸是精氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；與其他豆科類植物種子蛋白一樣，葡萄籽總蛋白缺乏含硫氨基酸，甲硫氨酸和半胱氨酸含量分別僅為0.86%和0.90%；葡萄籽蛋白中酸性、堿性、不帶電荷的極性氨基酸以及疏水氨基酸分別占總氨基酸含量的30.16%，8.56%，55.18%和36.25%；呈味氨基酸(天冬酰胺和谷氨酸)和甜味型氨基酸(甘氨酸和丙氨酸)分別占葡萄籽總蛋白中總氨基酸含量的30.16%和20.83%.此外，除了色氨酸，葡萄籽總蛋白中幾乎含有人體所有的必需氨基酸，約占總氨基酸含量的27.43%.其中，亮氨酸(7.86%)、纈氨酸(6.53%)以及異亮氨酸(4.63%)是最豐富的必需氨基酸.因此，作為種子貯藏蛋白的葡萄籽蛋白，含有均衡的氨基酸組成和高含量的精氨酸，與大豆分離蛋白具有相似結構組成，具有成為蛋白質或者氨基酸的膳食補充劑的潛力.

表3葡萄籽蛋白和大豆分離蛋白中氨基酸組成比較

Tab.3Acomparisonofaminoacidcompositionbetweengrapeseedsproteinandsoybeanproteinisolate

注：圖中數(shù)值為3次重復的均值±標準方差，ND代表沒有檢測到；GlxA=谷氨酸+谷氨酰胺；AsxB=天冬氨酸+天冬酰胺；CysC：胱氨酸+半胱氨酸；D 代表必需氨基酸.

2.4 葡萄籽蛋白二級結構分析

通過紅外光譜測定pH 7條件下的葡萄籽蛋白中蛋白質二級結構的變化(圖2).根據(jù)蛋白質二級結構紅外光譜特征譜帶和蛋白質特征吸收峰的歸屬可知，1 660～1 669 cm-1譜峰是酰胺I帶C=O的伸縮振動，1 535～1 539 cm-1譜峰是酰胺II帶C—N的伸縮振動和N—H的面內(nèi)變形振動，1 231～1 232 cm-1譜峰為酰胺III帶C—N伸縮振動和N—H面內(nèi)變形振動.葡萄籽蛋白光譜在3 300 cm-1左右有明顯的單峰，是蛋白質N—H伸縮振動和O—H伸縮振動的特征吸收峰.在以無規(guī)則卷曲構象為特征吸收的酰胺I譜帶1 660～1 669 cm-1處、酰胺II譜帶1 535～1 539 cm-1和酰胺III譜帶1 235 cm-1附近處都有明顯較強的吸收峰，說明葡萄籽蛋白二級結構中都是以無規(guī)卷曲結構為主.葡萄籽蛋白在1 288～1 290 cm-1有明顯的吸收，說明葡萄籽蛋白中也含有較多的α-螺旋結構(1 300～1 250 cm-1)，葡萄籽蛋白在1 231 cm-1附近的吸收代表其中的β-折疊結構(1 240～1 230 cm-1)也較穩(wěn)定，且含量少于α-螺旋結構.

圖2 傅里葉變換紅外光譜分析葡萄籽蛋白的二級結構

3 討 論

葡萄籽蛋白是葡萄籽的重要組分之一，其營養(yǎng)成分與其他油料作物或谷物種子蛋白具備一定的相似性，具有開發(fā)成膳食蛋白或功能蛋白的潛力.Wu和Lu通過電泳技術在葡萄籽中找到了一種Haze-Active蛋白[18]；葡萄籽蛋白還具有一些功能活性，如良好的可溶性及乳化性[19]，其蛋白提取物還可以用作葡萄酒的澄清劑[20]，表明葡萄籽蛋白還擁有特有的功能活性.因此，加強葡萄籽蛋白組成、結構及功能的研究具有一定的現(xiàn)實意義.在此背景下，本研究首先對葡萄籽各主要成分和金屬元素的含量進行了評估，確定了葡萄籽蛋白的應用基礎；通過雙向電泳結合質譜鑒定手段，確定了葡萄籽蛋白的主要成分為11S球蛋白，其功能主要是營養(yǎng)貯藏；通過氨基酸組成檢測及比較分析，確定了葡萄籽蛋白的營養(yǎng)價值；最后利用紅外光譜分析，對葡萄籽蛋白的二級結構進行了初步分析.研究結果將為葡萄籽蛋白的綜合利用及功能性產(chǎn)品的研發(fā)提供理論基礎.

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