大麥類病斑突變體bspl1的遺傳及生理生化分析

孫 揚(yáng)，陸文怡，張 艷，王廣洋，孫佳麗，薛大偉，張曉勤

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

大麥(HordeumvulgareL.)是世界上最主要和古老的栽培作物之一，具有生育期短、早熟、抗逆性強(qiáng)以及適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)，是全球種植面積僅次于玉米、小麥和水稻的谷類作物[1]，也是遺傳學(xué)模式植物之一.植物類病斑突變體(lesion mimic mutant，LMM)是指植物在沒有明顯損傷、逆境脅迫或者外界病原物侵染的條件下，能夠在葉片、葉鞘或者整株上自發(fā)形成壞死斑的一類突變體[2].研究發(fā)現(xiàn)有些類病斑突變體的發(fā)生與正常生理功能或細(xì)胞發(fā)育有關(guān)，有些卻與植物抗病抗逆的防衛(wèi)反應(yīng)緊密相關(guān)[3].這些類病斑壞死突變體的表型與植物在防衛(wèi)過程中的過敏反應(yīng)很相似，不少LMM在類病斑壞死形成之前或之后還表現(xiàn)出對(duì)病原物局部或系統(tǒng)抗性的增強(qiáng)，并且表現(xiàn)出與細(xì)胞程序性死亡 (programmed cell death，PCD) 有關(guān)[4]，由此推測(cè)類病斑壞死突變體和過敏反應(yīng)可能具有一些共同的形成機(jī)制.

大麥突變體研究為大麥分子遺傳學(xué)研究、基因功能分析和種質(zhì)資源創(chuàng)新提供有價(jià)值的材料[5].與水稻相比，大麥類病斑突變體目前研究較少.類病斑突變體中的局部組織壞死是一種在沒有病原菌侵染條件下自發(fā)形成的程序性細(xì)胞死亡，這種遺傳上的缺陷往往會(huì)導(dǎo)致植株對(duì)病蟲的抗性增強(qiáng)和防衛(wèi)基因的組成型表達(dá)，研究植物類病斑突變體壞死斑的形成機(jī)制對(duì)理解植物細(xì)胞程序性死亡的信號(hào)傳導(dǎo)途徑和抗病機(jī)理具有重要意義，同時(shí)對(duì)選育抗病性狀的材料來改良農(nóng)作物品種有積極的推動(dòng)作用.在前期工作中，本課題組從大麥浙農(nóng)大3號(hào)(ZJU3)的EMS突變體庫(kù)中鑒定到一個(gè)典型的類病斑壞死突變體[5]，命名為bspl1(barley spotted leaf 1)，該突變體從苗期開始葉片上會(huì)自發(fā)出現(xiàn)紅棕色的類病斑，至分蘗期后類病斑不再變大且不導(dǎo)致葉片枯死，不影響植株抽穗、結(jié)實(shí).本研究對(duì)bspl1進(jìn)行了生理和遺傳的初步分析，以期為今后該突變體基因的克隆及病斑形成的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

EMS誘變產(chǎn)生的類病斑突變體bspl1以及野生型大麥ZJU3.

1.2 抗氧化酶測(cè)定方法

分別取種植3、5、7周的bspl1和對(duì)照組ZJU3各3株，選取同一時(shí)期的葉片，混合后稱取0.5 g鮮樣加8 mL 0.05 mol/L PBS(pH7.8)于冰浴中研磨，4 ℃下1 000 r/min離心20 min，取上清液用于超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定，所有測(cè)定重復(fù)3次.

SOD活性測(cè)定采用氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)光還原法；POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚氧化法；CAT活性測(cè)定采用紫外吸收法.

1.3 類病斑性狀的遺傳分析

2 結(jié) 果

2.1 大麥類病斑突變體遺傳分析

表1 突變體bspl1與野生型ZJU3有性雜交試驗(yàn)結(jié)果

表2 突變體bspl1與Morex有性雜交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 類病斑突變體生理分析

2.2.1 超氧化物歧化酶活性

SOD是細(xì)胞內(nèi)自由基清除系統(tǒng)中一個(gè)關(guān)鍵性酶，在保護(hù)細(xì)胞器免遭活性氧(ROS)損害中起至關(guān)重要的作用，是衡量植物衰老的良好指標(biāo).測(cè)定超氧化物歧化酶活性的結(jié)果如圖1a所示，突變體bspl1的SOD活性在播種后5～7周較ZJU3明顯增高，由11.8 U/g(鮮質(zhì)量，以下同)升至18.5 U/g.而ZJU3的SOD活性則始終維持在10 U/g左右.

2.2.2 過氧化物酶活性

過氧化物酶廣泛存在于植物體中，是活性較高的一種酶，與呼吸作用、光合作用及生長(zhǎng)素的氧化等都有關(guān)系.在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化，一般在老化組織中活性較高，幼嫩組織中活性較弱.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)早衰減產(chǎn)的水稻根系中過氧化物酶的活性增加[6]，所以過氧化物酶可作為組織老化的一種生理指標(biāo).由圖1b可知，bspl1的POD活性隨著時(shí)間的推移逐步增大，在7周后達(dá)到22.2 U/g，而ZJU3的POD活性幾乎保持不變.這表明由于突變體中活性氧含量提高，過氧化物酶被激活而活性提高，加快了活性氧清除機(jī)制.

圖1 bspl1與ZJU3的SOD、POD及CAT活性

2.2.3 過氧化氫酶活性

過氧化氫酶是植物重要的保護(hù)酶之一，主要存在于乙醇酸循環(huán)體、過氧化物酶體及其它細(xì)胞器中，專一作用于H2O2，是植物體內(nèi)清除H2O2的主要酶類.過氧化氫酶活性測(cè)定結(jié)果(圖1c)表明，與野生型相比，突變體在3周以后過氧化氫酶的活性有了較大的提高，從3.6 U/g提高至6.2 U/g，表明由于突變體中活性氧含量提高，過氧化氫酶被激活而活性提高，加快了活性氧清除機(jī)制.

3 討 論

大麥類病斑突變體bspl1是經(jīng)EMS誘變處理而產(chǎn)生的葉片散布紅棕色的類病斑突變體.其性狀經(jīng)多代自交繁殖，已能穩(wěn)定遺傳.從bspl1與ZJU3以及bspl1與Morex的正反交結(jié)果看出F1代均表現(xiàn)為正常植株，F(xiàn)2代則出現(xiàn)類病變植株，且類病變突變體植株數(shù)與正常植株數(shù)的比例為1∶3.F2代的性狀分離比說明穩(wěn)定后的突變體植株的類病斑遺傳是符合孟德爾分離定律的，故可確定該類病變突變受一對(duì)隱性核基因控制.

很多復(fù)雜的原因可導(dǎo)致植物形成類病斑，既可能是基因突變引起的，也可能與外界環(huán)境如光照、溫度、濕度和養(yǎng)分等相關(guān).隨著越來越多LMM基因被發(fā)現(xiàn)、克隆與功能分析，植物類病斑突變體壞死斑表型形成機(jī)制的研究也越來越深入，目前已知的類病斑形成機(jī)制有以下幾種：1)抗病基因的改變或過量表達(dá).抗病基因的突變或者信號(hào)傳導(dǎo)途徑的改變引起細(xì)胞過敏反應(yīng)，從而導(dǎo)致大量的細(xì)胞程序性死亡，產(chǎn)生類病斑.例如番茄過量表達(dá)Pto基因[7]、玉米R(shí)PL位點(diǎn)[8]的突變導(dǎo)致類病斑的產(chǎn)生.2)植物的正常代謝途徑發(fā)生紊亂.研究發(fā)現(xiàn)葉琳代謝途徑中一系列催化酶基因發(fā)生突變可能引起植物產(chǎn)生類病斑[9].3)PCD失控導(dǎo)致植物類病斑壞死的發(fā)生.擬南芥Isd1突變體中，LSD1編碼的一個(gè)鋅指蛋白，對(duì)植物防衛(wèi)反應(yīng)和PCD起負(fù)調(diào)控作用；Kim等[10]發(fā)現(xiàn)水稻中的OsACD R1基因能編碼Raf-like有絲分裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKKK)，該激酶過量表達(dá)可誘導(dǎo)水稻葉片出現(xiàn)類病斑.4)環(huán)境因素(如光照、溫度與濕度等)的改變導(dǎo)致部分植株類病斑的形成.王建軍等[11]對(duì)6個(gè)類病斑表型的突變體材料進(jìn)行遮光實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)光源、溫度均影響類病斑的形成.5)水楊酸、茉莉酸和乙烯等激素以及其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子也和植物類病斑壞死的形成有關(guān)系.研究發(fā)現(xiàn)擬南芥類病斑突變體Isd6和Isd7中的水楊酸在類病斑的形成中起了關(guān)鍵作用[12].6)與ROS、自由基有關(guān).許多類病斑突變體都顯示在病斑周圍有ROS的積累.玉米類病斑突變體les22類病斑的形成是由于ROS造成的[13].

Dangl等[14]在1996年已證實(shí)了類病斑不是由病原菌導(dǎo)致的，而是植物程序性細(xì)胞死亡的產(chǎn)物.因此，類病斑突變體開始受到了廣泛的關(guān)注，并成為研究植物抗病性機(jī)制及程序性細(xì)胞死亡途徑的重要實(shí)驗(yàn)材料.在類病斑出現(xiàn)時(shí)，許多突變體都伴有與病原菌侵染相關(guān)物質(zhì)的組成性表達(dá)，包括酚類物質(zhì)的積累、胼胝體的沉積、植保素水平的上升以及活性氧中間代謝物(reactiveoxygenin termediate，ROI)的產(chǎn)生等，這些物質(zhì)具有抵抗或抑制病原菌的作用，尤其是ROI能直接殺死病原菌并啟動(dòng)過敏反應(yīng)[15].在水稻類病變中也普遍存在著在類病斑的周圍出現(xiàn)H2O2或O2-的過量積累[16-17].ROI的積累可能是其生物合成途徑中的某些關(guān)鍵酶(如NADPH氧化酶)的活性失調(diào)所引起.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，突變體植株bspl1的 SOD、POD、CAT 活性都明顯高于野生型植株，可見突變體植株中活性氧的積累明顯.這些結(jié)果表明，bspl1的類病斑的發(fā)生與細(xì)胞程序性死亡有關(guān).

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