肝膽胰惡性腫瘤患者游離DNA的含量及完整性的研究

陳 芳, 謝 麗, 禹立霞, 劉寶瑞

(1. 南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院腫瘤中心暨南京大學(xué)臨床腫瘤研究所, 江蘇 南京, 210008;2. 安徽省馬鞍山十七冶醫(yī)院, 安徽 馬鞍山, 243000)

原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌及胰腺癌的發(fā)病率占全部惡性腫瘤的第4及第7位，死亡率分別為第2位及第6位[1]。膽系惡性腫瘤發(fā)病率雖然沒有前兩種腫瘤高，但其預(yù)后差，5年生存率僅為2%～4%。這3種腫瘤因為發(fā)現(xiàn)時多為晚期，放化療不敏感，雖經(jīng)過系統(tǒng)治療，預(yù)后仍不佳。目前，手術(shù)仍然是這3種腫瘤主要治療手段，所以早期診斷尤為重要。但因其解剖原因，目前的檢測手段不能滿足臨床需求。循環(huán)游離DNA能夠反映腫瘤組織的遺傳學(xué)及生物學(xué)特征，故又被稱作“液體組織活檢”[2], 以其無創(chuàng)可反復(fù)檢測而備受關(guān)注。本研究以肝、膽、胰腺惡性腫瘤患者為對象，對其外周血中游離DNA含量及完整性進(jìn)行檢測及計算，探討其臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

腫瘤組選擇2014年1—3月在南京市鼓樓醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)或穿刺取得病理證實為惡性腫瘤的患者共43例。其中男24例，女19例，年齡34～84歲，中位年齡57歲；原發(fā)性肝細(xì)胞患者15例，膽道系統(tǒng)腫瘤患者14例(包括肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌5例，肝外膽管癌4例，膽囊癌5例)，胰腺癌14例。對照組共40例，其中男22例，女18例，年齡26～74歲，中位年齡50.7歲。

1.2 試劑及儀器

天根生物科技(北京)有限公司的TIANamp Blood DNA kit(天根全血DNA提取試劑盒), AppLera公司生產(chǎn)的SYBR Green PCR Master Mix(2x), 美國Stratagene公司生產(chǎn)的MX 3000P Real Time PCR System熒光定量PCR儀，及國產(chǎn)紫外分光光度計。

1.3 引物

ALU115引物上游: 5-CCTGAGGTCAGGA

GTTCGAG-3; ALU115引物下游:5-CCCGAGTAGCTGGGATTACA-3; ALU247引物上游:5-GTGGCTCACGCCTGTTAATC-3; ALU 247引物下游: 5-CAGGCTGGAGTGCAGTGG-3。

1.4 實驗方法

1.4.1 標(biāo)本的收集：收集術(shù)前肝、膽、胰腺惡性腫瘤患者外周靜脈血2 mL, EDTA抗凝。3 000 r/min離心15 min, 分離出400 μL血漿放入EP管中，-80 ℃冷凍保存。正常體檢患者血液處理同前。

1.4.2 外周血DNA的提?。喊凑誘IANamp Blood DNA kit試劑盒說明書，抽提所有標(biāo)本的血漿游離DNA標(biāo)本，放入-20 ℃冰箱保存，以便統(tǒng)一熒光定量。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：以健康人外周血細(xì)胞總DNA作為陽性對照，用紫外分光光度計檢測含量3次，取平均值，并將其稀釋為20.0 ng/μL。后再按5倍梯度稀釋，含量分別為4.0 ng/μL、0.8 ng/μL、0.16 ng/μL、0.032 ng/μL、6.4 pg/μL。

1.4.4 PCR反應(yīng)：采用實時熒光定量PCR進(jìn)行分析，總反應(yīng)體系為20 μL, 含2 μL DNA，10 μL SYBR Green PCR Master Mix，0.5 μL的二甲基亞砜和7.2 μL去離子水以及10 μmol/mL的引物上、下游各0.2 μL 。PCR擴增條件：95℃預(yù)變性10 min, 32個循環(huán)的95 ℃變性15 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s。每批標(biāo)本均同時設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線以便絕對定量，并以去離子水作為陰性對照。

1.5 數(shù)據(jù)處理

游離DNA的完整性=ALU247檢測的游離DNA含量/ALU115檢測的游離DNA含量。組間及組內(nèi)比較采用非參數(shù)檢驗，診斷效能判斷使用ROC曲線分析。SPSS 17.0統(tǒng)計運算及雙尾檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 惡性腫瘤患者組與對照組游離DNA含量及完整性比較

惡性腫瘤患者組短片段游離DNA含量中位數(shù)2.89 ng/μL(0.60～50.80ng/μL), 長片段游離DNA含量中位數(shù)為1.19 ng/μL (0.34～37.40 ng/μL), 均高于正常對照組0.85 ng/μL(0.49～9.11 ng/μL)及0.28 ng/μL(0.17～2.86 ng/μL), 2組有顯著差異(P<0.001)。而腫瘤組完整性0.37(0.15～0.95)相比于對照組0.33(0.08～0.67), 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 見表1。

表1 惡性腫瘤患者游離DNA含量及完整性與正常對照組的比較

與對照組比較，*P<0.05, **P<0.01。

2.2 3種腫瘤之間游離DNA含量與完整性的比較

原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌組短片段游離DNA含量中位數(shù)2.34 ng/μL, 長片段總游離DNA含量1.12 ng/μL, 完整性0.41; 膽道惡性腫瘤組為3.42 ng/μL, 1.225 ng/μL, 0.28; 胰腺癌組分別4.015 ng/μL, 1.16 ng/μL, 0.28。三種腫瘤在總游離DNA含量及長片段游離DNA含量上無明顯差異，而完整性則有明顯差異(P=0.033)。其中原發(fā)性肝細(xì)胞組完整性較對照組高(P=0.022), 而其他兩種腫瘤與對照組相比未見差異，見表1。

2.3 惡性患者游離DNA含量及完整性與各臨床資料的關(guān)系

血漿游離DNA含量及完整性與性別、年齡(≤60歲與>60歲組間)、腫瘤大小(5 cm為界)、神經(jīng)脈管是否受侵、腫瘤分期無顯著差異(P>0.05)，見表2。

表2 腫瘤患者游離DNA含量及完整性與臨床指標(biāo)間的關(guān)系

2.4 游離DNA含量與完整性對惡性腫瘤的診斷價值

以ALU115、ALU247為引物測得的游離DNA含量及其完整性制作ROC曲線。其中ALU115片段ROC曲線下的面積(AUC)為0.80，95%的可信區(qū)間(CI)為0.71～0.89(P<0.001)。選擇其最佳截斷濃度為2.21 ng/μL, 靈敏度60%, 特異度86.05%。而以長片段ALU247為引物AUC為0.85, 95% CI為0.77～0.93(P<0.001)。其最佳截斷濃度1.92 ng/μL時，此時靈敏度和特異度分別90%和62.79%。以完整性AUC僅為0.56，95% CI為0.44～0.69(P=0.327)。完整性在惡性腫瘤組及對照組無明顯差別，不能作為診斷依據(jù)。

3 討 論

眾所周知，病理診斷是腫瘤診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但肝、膽、胰腺由于其解剖位置的原因，許多腫瘤患者術(shù)前未能明確病理，多以影像學(xué)檢查聯(lián)合相關(guān)腫瘤指標(biāo)(CEA、AFP、CA199等)臨床診斷。但其靈敏度及特異性差，存在一定的誤診誤治的情況。且局部穿刺活檢，取得少量組織病理，一方面給患者帶來巨大痛苦，不利于長期的隨訪監(jiān)測；另一方面也很難反映腫瘤總體性狀。臨床上需要一種能夠提供早期診斷、高效、微創(chuàng)、靈敏度及特異性高的診斷方法。外周血游離DNA從1948年被發(fā)現(xiàn)至今[3]，經(jīng)歷70多年的歷史，尤其是近20年，人們從外周血DNA中發(fā)現(xiàn)與腫瘤組織相同的遺傳性狀[4]，認(rèn)為其有望代替現(xiàn)有的檢測手段用于臨床的腫瘤診斷及療效評估。 近些年，游離DNA的檢測多采用實時熒光定量PCR(RTFQ-PCR)檢測辦法，該辦法在以往的PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)上加入熒光基團，利用熒光信號的強弱對PCR反應(yīng)實時監(jiān)測，并通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行絕對定量。而ALU是人類基因組中最常見的重復(fù)序列，總長300 bp左右，共占人類基因組的5%～10%, 只要有合適的引物就能對ALU序列進(jìn)行擴增。兩項結(jié)合極大提高檢測的敏感性，甚至能檢測0.1 μL的血液標(biāo)本[5]。

本實驗利用ALU115及ALU247作為引物，建立了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別對腫瘤患者及正常人血漿中的游離DNA進(jìn)行RTFQ PCR檢測，并計算出其完整性及與臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行一些針對性的比較。得出結(jié)論示，惡性腫瘤患者血中ALU115片段含量及ALU247片段含量與正常體檢者存在明顯差異(P<0.001)。且ALU247片段含量在診斷上更加敏感，ROC曲線面積達(dá)到0.85，考慮與游離DNA的來源有一定的關(guān)系。雖然游離DNA的真正來源尚不明確，但大多數(shù)學(xué)者[6]認(rèn)為正常人血中游離DNA來源于細(xì)胞的凋亡，而腫瘤患者血中的游離DNA除了來源于細(xì)胞凋亡外，還來源于腫瘤細(xì)胞的壞死，腫瘤組織[7]及血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的釋放。所以腫瘤患者體內(nèi)的血中游離DNA的含量及長片段DNA的含量較正常人都更加豐富。Umetani等[8]使用ALU115及247片段擴增乳腺癌及正?；颊哐杏坞xDNA，發(fā)現(xiàn)在早在Ⅱ期患者血中游離DNA含量顯著高于正常(P=0.005)。本實驗Ⅰ～Ⅱ期患者血中總游離DNA含量及長片段游離DNA含量為2.70 ng/μL、1.18 ng/μL, 與正常對照組相比有顯著差異(P=0.002), 與Umetani的結(jié)論一致?？紤]與腫瘤早期，細(xì)胞增殖較快，大量游離DNA釋放入血，與正常對照組有明顯區(qū)別，敏感性高，對于腫瘤的早期診斷有一定指導(dǎo)意義。另有報道[9]游離DNA含量在各腫瘤類型之間存在區(qū)別，如同樣使用ALU115為引物，腸癌組患者AUC面積0.75，而壺腹部癌AUC面積僅0.59, 對于診斷的價值有明顯差異。故本研究又把3種腫瘤分開與正常對照組比較。結(jié)果顯示, ALU115片段含量及ALU247片段含量在肝膽胰患者與正常對照組之間雖然仍然有差異。但ALU115片段在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌診斷價值上(0.013)不如膽系惡性腫瘤及胰腺癌敏感(P<0.001)[10]。

本研究結(jié)果顯示，游離DNA的總量及長片段的含量與患者的年齡、性別、腫瘤大小、神經(jīng)受侵、脈管受侵、分期之間均無明顯差異。但有關(guān)于乳腺癌的研究[5]指出，游離DNA的含量與腫瘤大小相關(guān)。同樣見于原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌的研究[11-12], 認(rèn)為腫瘤>5 cm組與≤5 cm組有顯著差異(P<0.01), 且在Ⅰ～Ⅱ期患者與Ⅲ～Ⅳ期中有差別(P=0.01)。而本研究并未見相關(guān)性，后續(xù)可考慮增加樣本量進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果所示，游離DNA的完整性僅在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌的診斷上有意義(P=0.022)。而其他數(shù)據(jù)游離DNA的完整性均無統(tǒng)計學(xué)意義。

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