參芎葡萄糖注射液聯(lián)合依達拉奉對腦梗死患者血清HMGB1、ENA-78和S100β蛋白水平的影響

胡仁琳 李鳴 張弦

·論著·

參芎葡萄糖注射液聯(lián)合依達拉奉對腦梗死患者血清HMGB1、ENA-78和S100β蛋白水平的影響

胡仁琳 李鳴 張弦

目的觀察腦梗死患者血清高遷移率族蛋白-1(HMGB1)、中性粒細胞激活肽-78(ENA-78)和S100β水平的變化，并探討參芎葡萄糖注射液聯(lián)合依達拉奉對腦梗死的腦保護作用機制。方法采用隨機、對照、單盲的前瞻性研究。將本院卒中單元中符合納人標準的68例急性腦梗死患者按照隨機數(shù)字法分為A組34例和B組34例，A組采用西醫(yī)常規(guī)治療方法加用參芎葡萄糖注射液200 ml靜脈滴注,1次/d,B組在此基礎上加用自由基清除劑依達拉奉治療,2次/d，連續(xù)給藥14 d。A組和B組均檢測發(fā)病第1天(治療前)、第3天、第7天、第14天血清HMGB1、ENA-78和S100β蛋白水平；治療前、治療后1周、2周和3周神經(jīng)功能缺損評分采用斯堪的納亞卒中量表(SSS)評分日常生活能力評分(ADL)和Barthel指數(shù)(BI)評定。結果發(fā)病后第1天，A組和B組患者血清HMGB1、ENA-78和S100β水平均達峰值，繼之出現(xiàn)緩慢下降。在發(fā)病后第3天、第7天、第14天B組血清HMGB1、ENA-78和S100β含量均明顯低于A組(P<0.01)。治療后2周和3周,B組患者ADL、SSS評分均高于A組(P<0.01)。治療前，腦梗死患者血清S-100β蛋白水平與SSS、ADL評分均呈負相關(r值分別為-0.590和-0.534,P<0.01)，血清HMGB1水平與ENA-78水平呈正相關(r=0.883,P<0.01)。結論血清S-100β濃度可作為評估腦梗死后腦損傷嚴重程度的血清學指標，血清HMGB1和ENA-78可能參與了腦梗死后急性期炎性反應過程。依參芎葡萄糖注射液聯(lián)合依達拉奉具有減輕腦梗死后繼發(fā)炎性反應、保護腦細胞和提高患者神經(jīng)功能的作用。

腦梗死；參芎葡萄糖注射液；依達拉奉；高遷移率族蛋白-1;中性粒細胞激活肽-78；S-100β蛋白

目前，腦血管病已成為我國城市和農(nóng)村人口的第一位致殘和死亡原因，且發(fā)病有逐年增多的趨勢。流行病學研究表明，我國每年新發(fā)卒中病例150～200萬例，校正年齡后的年腦卒中發(fā)病率為(116～219)/10萬人口，年腦卒中病死率為(58～142)/10萬人口[1]。目前現(xiàn)存腦血管病患者700余萬人，其中約70%為腦梗死[1]。近年來研究表明，多種炎性介質及細胞因子參與了缺血、缺氧及再灌注的病理生理過程[2-4]。如何有效減輕神經(jīng)功能缺損，如何有效減輕卒中后炎性反應已成為目前研究的熱點和難題。在本研究中，我們將依達拉奉針劑和參芎葡萄糖注射液靜滴相結合，采用前瞻性隨機對照觀察，探討參芎葡萄糖注射液聯(lián)合依達拉奉治療腦梗死的療效及血清炎性因子的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2011年6月至2013年3月期間我院神經(jīng)內(nèi)科的住院患者中，所有入組患者共68例，其中男38例，女30例；年齡60～84歲，平均年齡(71±5)歲，采用隨機數(shù)字表法分為A組和B組，每組34例。2組患者一般資料具有可比性。正常對照組: 系同期我院健康體檢者100例，各項體檢均正常。其中男55例，女45例;平均年齡(55±14) 歲。所有研究對象用藥均征得患者本人和家屬同意，符合武漢市第五醫(yī)院倫理委員會制定的倫理學標準，簽署治療同意書。

1.2 入選標準 經(jīng)顱腦CT和(或)MRI確診為前循環(huán)腦梗死，入院時行美國國立衛(wèi)生院神經(jīng)功能缺損(NIHSS)評分8～19分，均未行溶栓治療，均符合缺血性卒中的診斷標準[5]，且發(fā)病48 h之內(nèi)，常規(guī)行頸部血管超聲檢查，參照中國缺血性卒中亞型(CISS分型)為大動脈粥樣硬化型[6]。 排除標準：無癥狀性腦梗死，梗死后出血和腦出血，2型糖尿病、血液病、自身免疫疾病、甲狀腺疾病、結核、惡性腫瘤、嚴重肝腎疾病，近2周嚴重感染，妊娠者。退出標準：(1)用藥過程中出現(xiàn)嚴重不良反應;(2)出現(xiàn)心腦血管病復發(fā)事件;(3)患者突發(fā)意外病死。

1.3 方法

1.3.1 治療方法：A組和B組患者均使用甘露醇、甘油果糖和速尿脫水、降顱內(nèi)壓、調(diào)控血壓(施慧達)、抗血小板聚集(拜阿司匹林片)、調(diào)脂(阿托伐他汀鈣片)和補液治療,脫水劑使用一般不超過14 d;A組加用參芎葡萄糖注射液(由貴州益佰醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，200 ml靜脈滴注，1次/d，連續(xù)滴注2周；B組在A組基礎上加用依達拉奉注射液(其商品名為必存,每支10 mg針劑,南京先聲藥業(yè)生產(chǎn))30 mg加入100 ml 0.9%氯化鈉溶液,2次/d,療程為14 d。A組使用等容積安慰劑0.9%氯化鈉溶液。2組治療期間均不再使用其他氧自由基清除劑及腦保護劑如尼莫地平等。

1.3.2 臨床神經(jīng)科評分：神經(jīng)功能缺損評分采用1989年的美國國立衛(wèi)生院卒中量表(NIHSS)、日常生活能力評分(ADL)標準采用Barthel指數(shù)(BI)和斯堪的納維亞卒中量表(SSS)評定。均由卒中單元中經(jīng)過培訓的神經(jīng)內(nèi)科專職人員負責評分并錄入。在患者入院治療前、治療后第1周、第2周和第3周分別評分1次。ADL和SSS評分越高，說明神經(jīng)功能缺損程度越輕。

1.3.3 生化檢測方法：正常對照組于體檢日清晨抽取空腹靜脈血3 ml。腦梗死患者入院后第1天(治療前)、第3天、第7天和第14天晨起空腹,抽取靜脈血5 ml,盡快分離血清,-70℃低溫保存待測。檢測前凍融,采用雙抗體夾心ELISA法測定血清高遷移率族蛋白(HMGB1)、中性粒細胞激活肽-78(ENA-78)和S100β含量,試劑盒均由武漢博士德公司提供，儀器為意大利產(chǎn)AZXM11-Alisei全自動酶標儀。操作嚴格按說明書進行,結果由酶標分析儀分析所得。此外，A組和B組入院后第1天、第7天和第14天均抽血檢測血常規(guī)、尿規(guī)及肝腎功能血脂心肌酶學等。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示,組間比較采用單因素方差分析、治療前后指標比較采用配對t檢驗,計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，相關性分析采用直線相關分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 治療前后2組患者血清HMGB1、ENA-78和S100β水平的比較 在發(fā)病后第1天，A組和B組患者血清HMGB1、ENA-78和S100β水平均明顯升高(P<0.01),且達峰值，繼之出現(xiàn)緩慢下降。在發(fā)病后第14天，A組和B組三項指標仍高于正常對照組(P<0.01)，但在發(fā)病后第3天、第7天、第14天B組血清HMGB1、ENA-78和S100β含量均明顯低于A組(P<0.01)。見表1～3。

表1 3組血清HMGB1比較

表1 3組血清HMGB1比較

注:與治療前比較，*P<0.01;與正常對照組比較，#P<0.01；與A組比較，△P<0.05,☆P<0.01

表2 3組血清ENA-78比較

表2 3組血清ENA-78比較

注:與治療前比較，*P<0.01;與正常對照組比較，#P<0.01；與A組比較，△P<0.05,☆P<0.01

表3 3組血清S100β比較

表3 3組血清S100β比較

注:與治療前比較，*P<0.01;與正常對照組比較，#P<0.01；與A組比較，△P<0.05,☆P<0.01

2.2 治療前后2組SSS和ADL評分的比較 治療前，(A組和B奉組)患者SSS評分和ADL評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在治療后第1周，2組患者SSS評分和ADL評分較入院時降低，但在治療后第2周和第3周，A組和B組患者SSS評分和ADL評分逐漸上升。在治療后第2周和第3周，B組患者SSS和ADL評分明顯高于A組(P<0.01)。見表4～5。

表4 A組和B組SSS評分比較 n=34，分

表4 A組和B組SSS評分比較 n=34，分

注：與治療前比較，*P<0.01；與A組比較，#P<0.01

表5 A組和B組ADL評分比較 n=34，分

表5 A組和B組ADL評分比較 n=34，分

注:與治療前比較，*P<0.01;與A組比較，#P<0.01

2.3 相關性分析 直線相關分析顯示：治療前，腦梗死患者(A組和B組)血清S-100β蛋白水平與SSS、ADL評分均呈負相關(r值分別為-0.590和0.534,P<0.01)，血清HMGB1水平與ENA-78水平呈正相關(r=0.883,P<0.01)。

2.4 不良反應 所有患者治療前后進行血、尿常規(guī)、肝腎功能、心電圖檢查，均未見明顯的改變。有3例出現(xiàn)輕度胃腸道反應，惡心，無嘔吐，可自行緩解。全部受試患者未見其他明顯的不良反應。

3 討論

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和人們?nèi)粘Ｉ钏降奶岣?，腦梗死的發(fā)病率越來越高，其高致死率和高致殘率給家庭和社會帶來了巨大的負擔。因此，如何采取有效的藥物治療，早期進行干預，減輕神經(jīng)功能缺失程度，促進神經(jīng)功能恢復顯得尤為重要。藥物治療目的是盡快恢復腦缺血區(qū)的血流供應，最大程度上改善腦內(nèi)微循環(huán)，有效地防治腦梗死進展加重。目前已有多項研究證實，多種炎性因子參與腦梗死后繼發(fā)炎性反應過程。

S-100β蛋白是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種特異性酸性鈣結合蛋白，主要由神經(jīng)膠質細胞合成和分泌。在生理狀態(tài)下,S100β蛋白以低濃度形式存在,它參與神經(jīng)細胞的再生與修復,可促進神經(jīng)生長,調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外能量代謝,并參與細胞內(nèi)信號通路傳導，具有神經(jīng)營養(yǎng)作用；但在病理狀態(tài)下,高濃度存在的S100β蛋白能夠刺激神經(jīng)膠質細胞產(chǎn)生大量致炎因子和一氧化氮,并通過一氧化氮依賴途徑導致神經(jīng)元功能障礙或神經(jīng)元細胞程序性死亡,具有直接的神經(jīng)毒性作用[7]。腦梗死后,神經(jīng)膠質細胞大量壞死、部分細胞活化,S100β蛋白釋放和合成增多,從而出現(xiàn)外周血或腦脊液中S100β蛋白濃度升高,而繼之出現(xiàn)的腦水腫、血腦屏障破壞則進一步加重了神經(jīng)組織損傷,最終誘導了細胞死亡或凋亡。在本研究中，治療前，A組和B組患者血清S100β水平均明顯高于正常對照組(P<0.05)，且于發(fā)病第1天達高峰，繼之出現(xiàn)緩慢下降。治療前，腦梗死患者(A組和B組)血清S-100β蛋白水平與SSS、ADL評分均呈負相關(P<0.05)，提示血清S-100β蛋白可作為判斷急梗死神經(jīng)功能缺損程度的有效血清學指標。

HMGB1是一種DNA結合蛋白，它廣泛分布于多種組織器官細胞( 如淋巴組織、腦、肝、肺等) 的胞核和胞漿中,是判斷某些細胞凋亡或壞死的一個關鍵信號，也是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的惟一的能在細胞外誘導細胞因子分泌和活化炎性細胞的核內(nèi)蛋白[8-10]。HMGB1作為一種重要的晚期炎性介質和致炎細胞因子[11]，參與了組織損傷后修復及多種炎性疾病的病理生理過程[12，13]，它作為啟動和維持炎性瀑布式反應的中心分子，在致炎因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)或白介素-1(IL-1)等的刺激下，單核-巨噬細胞釋放HMGB1，反過來HMGB1也可刺激單核-巨噬細胞分泌TNF-α、L-6,IL-8等炎性介質，這樣就形成了一個正反饋環(huán)路[14]。此外，HMGB1還可以刺激中性粒細胞產(chǎn)生趨化現(xiàn)象，增加上皮細胞的通透性，從而加重局部滲出和水腫，它還可能參與炎癥過程中免疫和內(nèi)分泌反應的調(diào)節(jié)[15]。因而，HMGB1可作為損傷后炎性反應藥物治療作用的靶點[16]。

在本研究中，入院后第1天，A組和B組血清HMGB1水平均明顯高于正常對照組(P<0.05)，且達高峰，繼之出現(xiàn)緩慢下降。分析其可能機制為腦梗死灶周邊腦組織存在缺血和缺氧，導致細胞功能受損、壞死后，炎性細胞大量被激活，炎性介質釋放入血，產(chǎn)生全身性的瀑布樣炎性反應[17]，繼而誘發(fā)了星形膠質細胞或神經(jīng)元細胞釋放HMGB1，而后者可刺激星形膠質細胞或神經(jīng)元細胞釋放MMP-9、IL-1和TNF-α等多種炎性因子[18]。如此反復，形成一個正反饋環(huán)路，進而導致血清中HMGB-1可在短時間內(nèi)迅速增加，隨著炎性反應的逐漸減弱，血清HMGB-1水平緩慢下降。

ENA-78由78個氨基酸組成，同屬于C-X-C亞族的趨化因子，在各種炎性介質如脂多糖(LPS)、IL-1、TNF-α等的誘導下均可表達，可由單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞等合成和釋放，但其主要來源為活化的巨噬細胞。ENA-78具有趨化和激活中性粒細胞作用，它既是炎性反應的重要介質，又是重要的血管增生因子。已有研究證實，ENA-78活性的增加與微血管通透性、炎性細胞侵入和水腫明顯相關[19]。

在本研究中，發(fā)病后第1天，A組和B組血清ENA-78水平均明顯高于正常對照組，且達高峰，繼之出現(xiàn)緩慢下降。經(jīng)直線相關分析提示，血清HMGB1水平與ENA-78水平呈顯著正相關(P<0.05)，分析其可能機制為腦梗死后周邊腦組織缺血缺氧后導致細胞損傷、壞死，大量炎性細胞浸潤，后者合成和釋放ENA-78；與此同時，星形膠質細胞或神經(jīng)元細胞釋放HMGB1增加[20]，HMGB1反過來刺激星形膠質細胞或神經(jīng)元細胞釋放多種炎性因子如TNF-α等，并可特征性的上調(diào)白細胞黏附分子(ICAM-1 和VCAM-1)，分泌中性粒細胞和內(nèi)皮細胞化學趨化素(IL-8和MCP-1)等，而TNF-α是關鍵的早期炎性介質，具有調(diào)節(jié)和放大炎性反應的作用[21]，隨著血清TNF-α水平的升高，炎性細胞浸潤亦增加，炎性反應進一步增強。因而，ENA-78和HMGB1二者互為因果關系。本研究結果顯示，血清ENA-78和HMGB1均可能參與了腦梗死急性期繼發(fā)性炎性反應過程。

依達拉奉是一種相對分子質量小的自由基清除劑，具有親脂基團，對血-腦屏障的通透率較高，靜脈給藥后可很容易地到達作用部位，清除腦內(nèi)的毒性自由基，并且通過打斷脂質過氧化反應鏈來抑制腦細胞(包括血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)元細胞、神經(jīng)膠質細胞)膜的過氧化反應，保持了腦細胞膜結構和功能的完整性，從而有效地抑制了遲發(fā)性神經(jīng)元死亡。參芎葡萄糖注射液是應用現(xiàn)代高科技生物學技術提取的中藥丹參、川芎有效化學成分單體而成。其中丹參的有效成分為丹參素，具有抗凝血和抗血小板聚集及促進纖維蛋白(原)降解作用，亦具有擴張收縮狀態(tài)的微小動脈，加快血液流速，消除血液瘀滯，改善微循環(huán)的作用。而川芎的有效成分為川芎嗪則具有抗氧化、抑制自由基的產(chǎn)生，減少神經(jīng)元細胞凋亡的作用。在本研究中，治療后第2周和第3周，B組患者SSS和ADL評分明顯高于A組患者(P<0.05)，提示參芎葡萄糖注射液聯(lián)合依達拉奉治療可更有效地改善腦卒中后神經(jīng)功能障礙。而且，在發(fā)病后第3天、第7天和第14天，B組血清HMGB1、ENA-78和S100β含量均明顯低A組(P<0.05)，提示參芎葡萄糖注射液聯(lián)合依達拉奉治療可通過快速有效地降低腦梗死患者急性期血清HMGB1、ENA-78和S100β水平來減輕腦梗死后繼發(fā)炎性反應。我們推測其可能作用機制為：參芎葡萄糖注射液聯(lián)合依達拉奉治療可能是通過清除自由基和抑制脂質過氧化，穩(wěn)定神經(jīng)元細胞膜，減少S-100β蛋白漏出，與此同時，由于腦細胞膜結構和功能的完整性得以保持，有效地抑制了遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，星形膠質細胞或神經(jīng)元細胞釋放HMGB1的含量降低，從而減輕了神經(jīng)元死亡后繼發(fā)的炎性反應，炎性反應介質如TNF-α等釋放減少，從而減少了對ENA-78的誘導產(chǎn)生。當然，其具體作用機制十分復雜，后期研究中，我們將更深入一步進行探討。

綜上所述，在我們的研究中,血清S-100β濃度可作為評估腦梗死后腦損傷嚴重程度的血清學指標，血清HMGB1和ENA-78可能參與了腦梗死后繼發(fā)炎性反應過程。參芎葡萄糖注射液聯(lián)合依達拉奉治療具有減輕腦梗死后炎性反應、保護腦細胞和提高患者神經(jīng)功能的作用。由于腦梗死后繼發(fā)炎性反應的病理生理機制相當復雜,因此在后期的研究中，我們將進一步推廣和擴大樣本量研究，并深入探討參芎葡萄糖液聯(lián)合依達拉奉對腦梗死的可能腦保護作用機制。

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