膽囊收縮素-8對高血壓大鼠腦出血后核因子-κB活性的影響

王恒 邵恩得 張金榮 吳立華

·論著·

膽囊收縮素-8對高血壓大鼠腦出血后核因子-κB活性的影響

王恒 邵恩得 張金榮 吳立華

目的探討膽囊收縮素-8(cholecystokinin-8,CCK-8)對高血壓性大鼠腦出血后血腫周圍組織核因子-κB(Necular Factor Kappa B,NF-κB)活性的影響。方法取成年SD大鼠72只，體重250～300 g，隨機分假手術(shù)組(n=12)、腦出血組(n=24)和CCK-8治療組(n=24)。采用電泳遷移率改變分析方法(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)檢測核內(nèi)NF-κB的活性，用免疫組化方法觀察NF-κB 在細胞內(nèi)的表達情況，并用干濕重法測量出血側(cè)腦組織含水量。結(jié)果腦出血組各時間點NF-κB的活性以及腦含水量較假手術(shù)組和CCK-8治療均有明顯增高(P<0.05)。結(jié)論腦出血后，腦組織NF-κB的表達明顯增加，CCK-8可以有效的抑制NF-κB的活性，這對于減輕NF-κB在腦出血后介導(dǎo)的繼發(fā)性炎性損害起到了積極的作用。

核因子-κB； 腦出血； 膽囊收縮素-8；炎癥

核因子-κB(NF-κB)是炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子，其活化后可激起腫瘤壞死因子(TNF-α)和白介素-1(IL-1)等促炎因子的表達，進而促進傷后炎性反應(yīng)。研究表明，腦出血后炎性介質(zhì)的大量表達與腦組織繼發(fā)損傷程度關(guān)系密切[1]。膽囊收縮素(CCK)是一種典型的腦腸肽，近年來許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)CCK-8具有抑制炎性反應(yīng)的作用，但國內(nèi)外還沒有CCK-8在抗腦出血后繼發(fā)炎性反應(yīng)方面的報道。本研究采用電泳遷移率改變分析及免疫組化的方法觀察CCK-8對高血壓性大鼠腦出血后血腫周圍NF-κB表達的影響，并對其機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 動物分組與模型制備 成年SD大鼠72只，體重250～300 g，隨機分為假手術(shù)組(12只)、腦出血組(24只)、CCK-8治療組(24只)，后兩組按出血后時間分為12、24、72 h三個亞組，每組8只大鼠，大鼠高血壓性腦出血模型采用雙側(cè)腎動脈前支部分熱凝，立體定位儀下自體血腦內(nèi)注入法建立。CCK-8治療組于出血前30 min,按40μg/kg，經(jīng)尾靜脈注射CCK-8(美國Sigma公司)，0.2 ml/只；腦出血組于試驗前30 min注射等量0.9%氯化鈉溶液，即0.2 ml/只；假手術(shù)組大鼠只制作大鼠高血壓動物模型，不進行其他操作。將各組動物按時間點斷頭處死，取出血灶前緣2 mm處腦皮質(zhì)100 μg，放于-70℃冰箱保存，用做電泳遷移率改變分析NF-κB的活性，另取出血灶邊緣(200±50)mg腦皮質(zhì)，用干濕重法測量腦含水量。剩余出血邊緣腦組織用4%多聚甲醛固定、脫水、包埋。將腦組織切成4 μm厚薄片，用免疫組化方法觀察腦出血后大鼠腦組織NF-κB的表達情況。

1.2 NF-κB的活性測定 參照Dignam等[2]的方法稍加改進。取出血灶邊緣2 mm處腦皮質(zhì)100 μg，4℃下經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌，離心(1 850×g,5 min)，加入5倍體積的BufferA(10 mmol/L HEPES，1.5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L KCl，0.5 mmol/L DTT，0.5 mmol/L PMSF，pH值7.9，0.5% NP-40)，離心(1 850×g、4℃、5 min)，向細胞沉淀中加入3倍原體積的BufferB(不含NP-40的BufferA)，冰浴10 min,在Dounce氏玻璃研磨器內(nèi)研磨成漿，振蕩混勻，離心(3 300×g,15 min)，去上清液，測量離心壓緊后的細胞核，加入2/3體積的BufferC(20 mmol/L HEPES pH值7.9，10 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L DTT，0.5 mmol/L PMSF，20%甘油)重懸細胞核，逐滴加入1/3體積的BufferD(20 mmol/L HEPES(pH值7.9)400 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2， 0.2 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L DTT，0.5 mmol/L PMSF，20%甘油)，振蕩冰浴1 h，離心(15 000×g、4℃、30 min)，上清即為核蛋白提取液。用考馬斯亮蘭G250染色測定蛋白濃度后，分裝于-70℃保存?zhèn)溆?。采用NF-κB凝膠遷移檢測試劑盒(美國 Promega公司)，按Gel Shift Assay System 試劑盒說明書說明，用T4多核苷酸激酶法以γ32P-ATP(北京亞輝生物公司)對NF-κB寡核苷酸探針進行放射性標(biāo)記，探針序列為5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’;3’-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5’。核蛋白與探針的結(jié)合反應(yīng)，取10 μg核蛋白與γ32P標(biāo)記的DNA探針(3.5 pmol,10μCi),在室溫下進行結(jié)合反應(yīng)30 min，反應(yīng)體系為：1 mmol/L MgCl2,0.5 mmol/L EDTA,0.5 mmol/L DTT,50 mmol/L NaCl,10 mmol/L Tris-HCl (pH值7.5),0.05 μg poly(dI-dC) 和4% 甘油，總體積為10 μl。反應(yīng)物經(jīng)4%聚丙烯酰胺凝膠電泳，300 V，電泳40～50 min。取下凝膠放在保鮮膜上，在抽干機上抽干，放入-70℃冰箱曝光24 h，用凝膠分析軟件對特異性條帶進行光密度分析。

1.3 腦含水量測定 各組試驗大鼠按時間點斷頭處死后立即開顱，取腦出血灶邊緣約2 mm處腦皮質(zhì)約(200±50)mg,用濾紙吸干表面水分，放在鋁箔上用電子天平稱濕重，然后置恒溫干燥箱內(nèi)，100℃烘烤24 h,取出秤干重后計算腦組織含水量。參照Elliot公式計算，腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4 免疫組化法觀察NF-κB的表達 取出血灶后約4 mm層厚的腦組織進行固定和石蠟包埋，包埋好的組織蠟塊在石蠟切片機上進行連續(xù)切片，片厚約為5 μm。采用SP法進行免疫組化染色觀察，小鼠抗NF-κP65( SC-8008)單抗購Santa Cruz 公司，二抗及辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素均購自北京中山生物工程公司，DAB鏡下顯色，細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性結(jié)果。高倍鏡下(400倍)在挫傷灶周圍隨機取4個視野計數(shù)陽性細胞。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NF-κB的DNA結(jié)合活性分析 EMSA電泳條帶，條帶掃描結(jié)果經(jīng)光密度值分析顯示,腦出血后12 h NF-κB表達明顯增加，24 h達高峰。CCK-8治療組各時間點NF-κB的DNA結(jié)合活性較腦出血組比有明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表1。

2.2 腦含水量測定 假手術(shù)組大鼠各時間點腦組織含水量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。腦出血組各時間點腦含水量與假手術(shù)組相比均有增高(P<0.05)，在傷后24 h達高峰，持續(xù)到72 h。CCK-8治療組腦含水量與腦出血組比較顯著減少(P<0.05)。見表2。

2.3 免疫組織化學(xué)檢測NF-κB變化 NF-κB在神經(jīng)元細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞內(nèi)均可見陽性表達(圖2)。腦出血組大鼠腦組織12 h陽性細胞表達明顯增加，24h達到高峰，這與EMSA結(jié)果相一致。CCK-8治療組NF-κB的陽性表達明顯減少，與腦出血組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2、表3。

圖1 EMSA檢測各組動物不同時間點細胞核中NF-κB的DNA結(jié)合 活性

表1 3組動物不同時間點NF-κB的DNA結(jié)合活性比較

表2 3組動物不同時間點腦含水量比較

圖2 出血后各時間點大鼠腦組織NF-κB(免疫組化×400)

3 討論

NF-κB是一種具有多向性轉(zhuǎn)錄激活功能調(diào)節(jié)分子，它與靶基因上特定的κB序列結(jié)合從而調(diào)節(jié)該基因轉(zhuǎn)錄，這些基因在調(diào)控細胞的增殖、分化、凋亡、免疫及炎性反應(yīng)等多方面均起著關(guān)鍵性作用。腦出血后短時間內(nèi)即會出現(xiàn)NF-κB的活化[3]，并通過編碼ICAM-1、TNF-α、IL-1、IL-6等因子的表達參與顱腦出血后的炎性反應(yīng)過程，由于TNF-α和IL-1這兩個因子又是NF-κB的激活物，它們與NF-κB共同形成了一個正反饋系統(tǒng)，所以一旦NF-κB激活引起炎性反應(yīng)，這一反應(yīng)將會持續(xù)一段時間，在腦出血后NF-κB的高表達正是通過繼發(fā)性炎性反應(yīng)這一過程加重了腦損傷[4]。

表3 3組動物不同時間點NF-κB陽性細胞表達情況比較

我們試驗結(jié)果顯示，大鼠急性腦出血后12 h NF-κB表達明顯增加，主要表現(xiàn)在神經(jīng)元細胞和小膠質(zhì)細胞內(nèi)，24 h表達達高峰，72 h后表達開始下降，但仍高于假手術(shù)組。通過EMSA對NF-κB的DNA結(jié)合活性進行分析，其結(jié)果與免疫組化結(jié)果完全一致。為了更好的說明NF-κB與腦出血后繼發(fā)性炎性損傷的關(guān)系，我們還檢測了大鼠腦出血后腦含水量的變化，腦出血組大鼠在傷后12 h 挫傷灶周圍腦組織含水量明顯升高，24 h達到高峰，并持續(xù)升高到72 h，與劉春梅等[5]研究結(jié)果一致。由此可見NF-κB的活性表達與腦組織損傷后組織形態(tài)學(xué)變化在時間上具有一致性，說明NF-κB在出血后通過級聯(lián)擴大的炎性反應(yīng)加重了腦組織水腫，在腦出血后繼發(fā)性損傷過程中扮演了重要的角色[6]。

膽囊收縮素(cholecystokinin,CCK)是一種典型的腦腸肽，主要化學(xué)成分為氨基酸多肽。CCK在人腦中主要分布于大腦皮層、海馬、杏仁核、下丘腦、脊髓等。在CCK家族中CCK-8的硫化形式(CCK-8s)是可發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的最小的活性片段。研究表明CCK-8在脂多糖誘導(dǎo)的肺組織炎癥中有抑制NF-κB的活性和炎性因子的促炎作用，有效減輕了脂多糖引起的肺組織病理組織學(xué)變化[7]。扈玉華等[8]通過實驗觀察到CCK-8可顯著抑制大鼠脊髓損傷后NF-κB活性的表達，并具有劑量依賴性，其減輕了脊髓傷后繼發(fā)性炎性損傷。我們的結(jié)果顯示，CCK-8治療組大鼠腦組織NF-κB表達較腦出血組比較明顯減少(P<0.05)；同時我們檢測的腦含水量結(jié)果顯示，CCK-8治療組腦含水量明顯低于腦出血組(P<0.05)。這一結(jié)果充分說明CCK-8在腦出血后的繼發(fā)性損傷過程中起到了積極的保護作用。

在腦出血后NF-κB通過激活TNF-α、IL-1等炎性因子的表達，使血腫周圍腦組織的炎性反應(yīng)進一步擴大，加重了腦組織的繼發(fā)性損傷。CCK-8可有效的對NF-κB的活化進行抑制，從而減少了其下游激活產(chǎn)物引起的繼發(fā)性炎性損害。CCK-8抑制NF-κB活化的機制我們可歸結(jié)為：(1) 抗氧化作用，目前大量實驗證實神經(jīng)系統(tǒng)損傷早期即有氧自由基增加和細胞膜脂質(zhì)過氧化的現(xiàn)象。已知氧化應(yīng)激是NF-κB激活的重要途徑，而CCK-8可提高血液超氧化物酶歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性，其具有抗氧化效應(yīng)[9]，從而間接的抑制了NF-κB的激活；(2) 抑制IκB的降解，在IκB介導(dǎo)的對NF-κB抑制的過程中需要p38 MAPK的激活，而CCK-8可以增強p38MAPK的活性程度[10]，從而間接的增強了IκB對NF-κB的抑制。CCK-8與其受體結(jié)合后，可激活cAMP-PKA信號傳導(dǎo)途徑，從而抑制IκB蛋白的降解；(3)抑制TNF-α基因的表達，TNF-α是一個早期的重要炎性介質(zhì)，由于TNF-α能促進IL-1和IL-6等炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，并且與NF-κB形成正反饋激活機制，所以其結(jié)果可以引起級聯(lián)式的炎性反應(yīng)，引起持續(xù)損害。研究發(fā)現(xiàn)CCK-8能顯著抑制TNF-α的活性表達[11]，這一結(jié)果也提示我們CCK-8也通過這一途徑間接抑制了NF-κB的活化。

總之，在腦出血后所引起的繼發(fā)性炎性損害中，NF-κB的高度表達扮演了關(guān)鍵的角色，而CCK-8通過對NF-κB活性的抑制作用，有效的減輕了這一損傷程度。這為我們對臨床腦出血的治療提供新的思路，本實驗是有關(guān)CCK-8在腦出血后應(yīng)用的初步研究，其中的許多病理生理機制仍未闡明，相信通過以后進一步研究會為腦出血的治療提供更為廣闊的前景。

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Effects of cholecystokinin 8 on NF-κB activity in rats with hypertensive intracerebral hemorrhage

WANGHeng,SHAOEnde,ZHANGJinrong,etal.DepartmentofNeurosurgery,LangfangPeople’sHospital,HebeiLangfang065000,China

ObjectiveTo investigate the effect of cholecystokinin-8 (CCK-8) on the changes of Necular Factor Kappa B (NF-κB) activity in rats with hypertensive intracerebral hemorrhage.MethodsSeventy-two adult Sprague-Dawley rats,weighted 250～300g,were randomly divided into three groups: control group,cerebral hemorrhage group and CCK-8 treatment group.The activity of NF-κB was detected by electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and the expression of NF-κB in cells was detected by immunohistochemical methods,and water content in brain tissue of injury part was measured.ResultsThe activity of NF-κB and brain water content in cerebral hemorrhage group were significantly increased,as compared with those in control group and CCK-8 group (P<0.05).ConclusionThe expression levels of NF-κB are obviously increased immediately after intracerebral hemorrhage,and CCK-8 can inhibit effectively the activity of NF-κB,which relieves the damage of secondary inflammatory reaction induced by NF-κB after intracerebral hemorrhage.

NF-κB;cerebral hemorrhage; CCK-8; inflammation

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.06.003

065000 河北省廊坊市人民醫(yī)院神經(jīng)外科(王恒、邵恩得、張金榮)，磁共振導(dǎo)航介入診療科(吳立華)

邵恩得，065000 河北省廊坊市人民醫(yī)院神經(jīng)外科；

E-mail: endeshao@163.com

R 743.34

A

1002-7386(2014)06-0812-04

2013-10-18)