轉(zhuǎn)GsbZIP33基因苜蓿的耐鹽性分析

陳明明，成舒飛，王家佳，趙超越，才 華，朱延明

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物功能基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030)

植物生產(chǎn)層

轉(zhuǎn)GsbZIP33基因苜蓿的耐鹽性分析

陳明明，成舒飛，王家佳，趙超越，才 華，朱延明

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物功能基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030)

本研究以前期獲得的耐鹽轉(zhuǎn)基因苜蓿(Medicagosativa)的兩個(gè)株系b32和b77及其受體對(duì)照野生型苜蓿品種為材料，經(jīng)200 mmol·L-1NaCl處理15 d 后，系統(tǒng)地測(cè)定了與耐鹽性相關(guān)的生理生化指標(biāo)，包括葉片凈光合速率(Pn)，抗氧化酶(SOD，CAT，POD)活性、可溶性糖含量，Na+、K+含量等。結(jié)果表明，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因苜蓿新株系b32、b77的可溶性糖含量分別增加了48.8%和39.6%；SOD活性分別升高了71%和89%；CAT活性分別升高了21%和13%；POD活性分別升高了32.9%和34.1%，Na+含量分別降低了57%和44%，K+含量分別增長(zhǎng)了21%和13%；兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(b32、b77)的光合速率是對(duì)照的2.4倍和2.5倍，以上指標(biāo)差異均極顯著(P<0.01)，表明轉(zhuǎn)GsbZIP33的兩個(gè)株系b32和b77提高了耐鹽性。

凈光合速率；抗氧化酶；可溶性糖；離子含量；耐鹽性

堿性亮氨酸拉鏈(Basic Region/Leucine Zipper motif，bZIP)轉(zhuǎn)錄因子是真核生物轉(zhuǎn)錄因子中分布最廣泛、最保守的一類轉(zhuǎn)錄因子，植物bZIP轉(zhuǎn)錄因子包含DNA序列相結(jié)合的富含堿性氨基酸的結(jié)構(gòu)域和與其相鄰的亮氨酸拉鏈區(qū)[1]。根據(jù)DNA結(jié)合的特異性和序列相似性，將bZIP轉(zhuǎn)錄因子分成Ⅰ～Ⅺ共11個(gè)亞族[2]或13個(gè)亞族(A～S)[3]，bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族可以與ABA響應(yīng)元件結(jié)合因子(AREB) 或ABRE結(jié)合蛋白(ABF)結(jié)合，啟動(dòng)下游基因的表達(dá)。植物界中bZIP轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在并參與各種生物學(xué)過程，包括病菌防御、光及各種脅迫信號(hào)、種子萌發(fā)和花器官發(fā)育[4]。研究表明，在煙草(Nicotianatabacum)里超表達(dá)轉(zhuǎn)ThbZIP基因后，增加了過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性并且調(diào)節(jié)了可溶性糖和可溶性蛋白的合成，從而改善了耐鹽性[5]；組成性表達(dá)ABP9的轉(zhuǎn)基因擬南芥(Arabidopsisthaliana)改善了脅迫下植物的光合能力[6]，還可以降低細(xì)胞活性氧水平，增強(qiáng)活性氧清除相關(guān)基因的表達(dá)，減輕活性氧的傷害[7]； Yang等[8]發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)AtbZIP24基因擬南芥的耐鹽能力與葉中鈉離子的積累減少有關(guān)；超表達(dá)AtbZIP60通過增強(qiáng)抗氧化酶的活性減弱了鹽誘導(dǎo)的氧化傷害[9]；在擬南芥中超表達(dá)PtrABF基因，可以通過清除活性氧和調(diào)節(jié)壓力響應(yīng)基因的表達(dá)從而增強(qiáng)耐脅迫性[10]；超表達(dá)GmbZIP1基因的擬南芥在鹽脅迫條件下會(huì)誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，減少失水從而增強(qiáng)耐鹽性[11]。以上研究表明，bZIP轉(zhuǎn)錄因子在鹽脅迫反應(yīng)中起著重要的積極作用。

迄今，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)苜蓿的耐鹽堿轉(zhuǎn)基因做了大量的研究，將AlfinI基因?qū)胲俎Ｖ?，增?qiáng)了植物生長(zhǎng)且耐鹽性得到提高[12]，另外，BADH、GmDREB1、H+-PPase、SsNHX1、NTHK1等基因也被導(dǎo)入苜蓿，轉(zhuǎn)基因株系均表現(xiàn)出不同程度的耐鹽性。將GsGST14[13]、GsZFP1[14]、GsCBRLK[15]等基因轉(zhuǎn)化肇東苜蓿獲得大量的轉(zhuǎn)基因株系，也具有較強(qiáng)的耐鹽性。如何從大量的轉(zhuǎn)基因材料中篩選出耐鹽堿新品(種)系，對(duì)其進(jìn)行耐鹽堿相關(guān)的生理生化指標(biāo)檢測(cè)是一項(xiàng)很重要的工作。本研究以前期獲得的轉(zhuǎn)GsbZIP33苜蓿兩個(gè)新株系b32和b77為材料，系統(tǒng)測(cè)定與耐鹽相關(guān)的生理生化指標(biāo)，以期鑒定其耐鹽能力。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

耐鹽轉(zhuǎn)GsbZIP33苜蓿株系b32和b77及其受體對(duì)照品種非轉(zhuǎn)基因野生型肇東苜蓿(M.sativacv.Zhaodong)。

1.2試驗(yàn)處理

本研究采用無性扦插繁殖的方式獲得扦插苗，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且長(zhǎng)勢(shì)一致的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因株系的扦插苗進(jìn)行耐鹽性分析。根據(jù)魏正巍[16]前期研究中對(duì)肇東苜蓿耐鹽性的分析，選擇兩個(gè)鹽濃度處理：0和200 mmol·L-1NaCl，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)有8株，每?jī)商旄鼡Q一次1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配制的NaCl溶液，以防止因水分蒸發(fā)造成的NaCl濃度變大，處理15 d后取樣，測(cè)定各項(xiàng)生理生化指標(biāo)。

1.3測(cè)定項(xiàng)目及方法

可溶性糖含量測(cè)定采用蒽酮比色法[17]；SOD活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑法[16]； 過氧化氫酶活性(CAT)的測(cè)定采用紫外分光光度法[18]；POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚顯色法[17]；光合指標(biāo)測(cè)定采用Li-6400便攜式光合測(cè)定系統(tǒng)分析儀(USA，LI-COR)，測(cè)定時(shí)間為09:30-11:30；K+、Na+含量的測(cè)定采用火焰光度法[19]。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，采用Excel 2010制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)基因株系可溶性糖含量測(cè)定

在未脅迫處理時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系b32和b77與野生型(對(duì)照)相比，可溶性糖含量無明顯差異(圖1)。在200 mmol·L-1NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因和對(duì)照株系的可溶性糖含量均升高，但兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(b32和b77)的可溶性糖含量都顯著高于野生型(P<0.01)。其中，對(duì)照為27.35 μg·g-1，轉(zhuǎn)基因株系b32和b77的可溶性糖含量分別為40.70和38.19 μg·g-1，分別較對(duì)照高出48.8%、39.6%。

2.2轉(zhuǎn)基因株系抗氧化酶(SOD,CAT,POD)活性測(cè)定

在未脅迫處理時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系b32和b77的SOD活性均較低，在200 mmol·L-1NaCl脅迫后，轉(zhuǎn)基因和對(duì)照株系的SOD活性迅速增強(qiáng)。其中，轉(zhuǎn)基因株系的SOD活性分別為128.66和142.37 U·g-1，對(duì)照為75.20 U·g-1，兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的SOD活性都顯著高于對(duì)照(P<0.01)，分別較對(duì)照高出71%、89%(圖1)。

在未脅迫處理時(shí)，兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的CAT活性顯著高于對(duì)照(P<0.01)，在200 mmol·L-1NaCl脅迫后，轉(zhuǎn)基因和對(duì)照的CAT活性迅速增強(qiáng)。其中，對(duì)照為38.21 U·mg-1·min-1，b32和b77的CAT活性分別為46.50和43.23 U·mg-1·min-1，均顯著高于對(duì)照，分別較對(duì)照高出21%和13%(圖1)。

圖1 轉(zhuǎn)基因株系可溶性糖含量，SOD,CAT和POD活性的測(cè)定Fig.1 Measurement of soluble sugar content，SOD,CAT and POD in transgenic lines

注：不同大寫字母表示同一處理不同株系之間差異極顯著(P<0.01)。下同。

Note: Different capital letters for the same treatment show significant difference among three lines at 0.01 level.The same below.

在未脅迫處理時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系b77的POD活性顯著高于對(duì)照(P<0.01)，b32與對(duì)照無明顯差異，在200 mmol·L-1NaCl脅迫后，轉(zhuǎn)基因和對(duì)照的POD活性迅速增強(qiáng)。其中對(duì)照為42.5 U·mg-1·min-1，b32和b77的POD活性分別為56.5和57.0 U·mg-1·min-1，兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的POD活性都極顯著高于對(duì)照，分別高出32.9%、34.1%(圖1)。

2.3轉(zhuǎn)基因苜蓿K+、Na+、K+/Na+含量測(cè)定

在未脅迫處理時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系b32和b77與對(duì)照相比，K+、Na+含量無明顯差異(圖2)。在200 mmol·L-1NaCl處理下，轉(zhuǎn)基因和對(duì)照株系K+、Na+離子的積累量較未脅迫處理均表現(xiàn)為K+含量降低，Na+含量提高，K+/Na+比值降低(圖2)。脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因株系b32和b77的Na+含量分別為4.46和5.78 mg·g-1，對(duì)照為10.36 mg·g-1；轉(zhuǎn)基因株系b32和b77的K+含量分別為5.716和5.336 mg·g-1，對(duì)照為4.706 mg·g-1，兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(b32和b77)的K+顯著高于對(duì)照(P<0.01)，分別增長(zhǎng)了21%和13%，Na+含量都顯著低于對(duì)照，分別降低了57%和44%。

圖2 轉(zhuǎn)基因株系Na+,K+,K+/Na+和光合速率測(cè)定Fig.2 Measurement of Na+,K+, K+/Na+ and photosyntheticrate content in transgenic lines

2.4轉(zhuǎn)基因苜蓿光合速率測(cè)定

在未脅迫處理時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系b32和b77與對(duì)照相比，光合速率無明顯差異(圖2)。在200 mmol·L-1NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系的光合速率分別為2.76和2.83 μmol·m-2·s-1，對(duì)照為1.14 μmol·m-2·s-1，轉(zhuǎn)基因和對(duì)照株系的光合速率較未脅迫均減弱，但兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(b32、b77)的光合速率都顯著高于野生型(P<0.01)，兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的光合速率分別是對(duì)照的2.4倍和2.5倍。

3 討論與結(jié)論

植物耐鹽性受多重因素的調(diào)節(jié)和控制，包括無機(jī)滲透調(diào)節(jié)、有機(jī)滲透調(diào)節(jié)、調(diào)控抗氧化防御系統(tǒng)和調(diào)節(jié)光合作用等。細(xì)胞中可溶性糖的含量是反映細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)的生理指標(biāo)之一[20]。滲透調(diào)節(jié)是植物適應(yīng)鹽脅迫的一種重要調(diào)節(jié)機(jī)制，保護(hù)植物細(xì)胞在鹽脅迫下的滲透失衡，穩(wěn)定亞細(xì)胞組織如細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)?？扇苄蕴呛刻岣撸山档图?xì)胞滲透勢(shì)，使細(xì)胞具有較強(qiáng)的保水能力，維持細(xì)胞的正常膨壓，以維持正常的生理活動(dòng)。本研究中，在200 mmol·L-1NaCl脅迫下，可溶性糖的含量明顯高于對(duì)照，由此表明GsbZIP33基因作為轉(zhuǎn)錄因子，能提高轉(zhuǎn)基因苜蓿的滲透調(diào)節(jié)能力，增強(qiáng)了耐鹽性。

植物抗氧化防御機(jī)制是植物抵抗鹽脅迫的重要途徑。鹽分能增加細(xì)胞膜的透性，加強(qiáng)脂質(zhì)的過氧化，破壞膜結(jié)構(gòu)[21]，而光合電子傳遞鏈仍保持較高的活性，這會(huì)導(dǎo)致電子傳遞鏈PSI端的過還原，從而產(chǎn)生大量超氧陰離子(·O2-)、H2O2和·OH等多種活性氧自由基[21]。SOD能催化·O2-發(fā)生歧化反應(yīng)，降低超氧離子對(duì)膜系統(tǒng)的傷害，CAT、POD是清除過氧化氫的關(guān)鍵酶，H2O2可作為底物直接激活CAT酶的活力，也可以通過基因表達(dá)的方式激活過氧化氫酶基因的表達(dá)[22]。三者協(xié)同作用，共同清除細(xì)胞內(nèi)過多的自由基,避免細(xì)胞的結(jié)構(gòu)受到損傷。有研究報(bào)道，bZIP基因是組織游離氧損害的關(guān)鍵基因，對(duì)植物抗逆脅迫起關(guān)鍵作用[23]，本研究中，在200 mmol·L-1NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因苜蓿苗的3種抗氧化酶活性均顯著高于野生型。綜合已有結(jié)果，說明轉(zhuǎn)基因株系清除鹽脅迫產(chǎn)生的過氧化氫的能力明顯高于對(duì)照，有利于保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的蛋白和膜系統(tǒng)免受氧化脅迫的傷害，增強(qiáng)其在高鹽環(huán)境下的耐受能力。

高等植物耐鹽還通過調(diào)節(jié)無機(jī)離子的種類、數(shù)量和比例來維持細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)定。細(xì)胞內(nèi)鈉、鉀離子濃度及比例的變化與植物的耐鹽性存在一定的關(guān)系，并影響細(xì)胞膜的透性、鹽離子毒害程度及離子的區(qū)隔化等逆境生理過程。轉(zhuǎn)基因番茄(Lycopersiconesculentum)的耐鹽機(jī)理是在于根系對(duì)K+、Na+的選擇吸收和K+、Na+在根、莖、葉等整株水平上的區(qū)域化分配[24]。本研究中，在200 mmol·L-1NaCl處理下，轉(zhuǎn)基因苜蓿苗地上部的鈉離子含量比對(duì)照低，推測(cè)轉(zhuǎn)基因苜蓿通過根系對(duì)土壤中鹽分離子的選擇吸收，限制鈉離子向地上部的運(yùn)輸，降低對(duì)葉器官的傷害，使植物耐鹽。

鹽往往造成植物生物量的下降,而生物量的改變與光合作用的變化密切相關(guān)[25],鹽害可以使葉綠素含量降低，影響光合電子傳遞，降低RUBP羧化酶的羧化效率，從而降低光合效率，因此，鹽脅迫下植物能否保持較高的光合效率十分關(guān)鍵。bZIP基因是葉綠體內(nèi)光合損傷的適應(yīng)性反應(yīng)基因，可以保護(hù)和修復(fù)光合元件[23]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鹽脅迫后，轉(zhuǎn)基因苜蓿葉綠素含量也明顯高于未轉(zhuǎn)基因株系[26]。本研究中，轉(zhuǎn)基因和對(duì)照相比，光合速率下降的幅度較小，說明轉(zhuǎn)基因光合元件受迫害的程度較小，轉(zhuǎn)基因苗耐鹽能力增強(qiáng)，推測(cè)GsbZIP33基因直接或間接調(diào)節(jié)了光合相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。

綜合各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果，轉(zhuǎn)GsbZIP33基因的苜?？梢酝ㄟ^提高鹽脅迫下苜蓿苗的可溶性糖的含量和抗氧化酶活性，升高K+/Na+，增強(qiáng)光合速率，從而減輕植株的鹽傷害的程度, 增強(qiáng)了耐鹽性。

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(責(zé)任編輯 武艷培)

SaltstresstoleranceoftransgenicalfalfawiththeGsbZIP33gene

CHEN Ming-ming, CHENG Shu-fei, WANG Jia-jia, ZHAO Chao-yue, CAI Hua, ZHU Yan-ming

(Key Laboratory of Agricultural Biological Functional Genes, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

In the present study，the physiological and biochemical indicators of two salt-tolerant transgenic lines (b32 and b77) and the wild type alfalfa were compared after 15 days treated with 200 mmol·L-1NaCl, including soluble sugar content, the activities of catalase (CAT)，peroxidase (POD) and superoxide dismutase (SOD), photosynthetic rate (Pn) and the content of K+and Na+.Compared with the wild type plants, the soluble sugar content of the two transgenic lines increased by 48.8% and 39.6%, respectively, the SOD activities increased by 71% and 89 %, CAT activities increased by 21% in b32 and 13% in b77, POD activities increased by 32.9% and 34.1%, Na+contents decreased by 57% and 44% and K+contents increased by 23% and 13%, respectively.The photosynthetic rate of transgenic plants increased by 2.4 times compared with the wild type plants.This study demonstrated that the transgenic alfalfa (b32 and b77) had a greater tolerance of saline stress compared with non-transgenic plants．

net photosynthetic rate； antioxidant enzyme; soluble sugar; ion content; salt tolerance

ZHU Yan-ming E-mail：ymzhu2001@neau.edu.cn

2014-01-24 接受日期：2014-05-20

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2011ZX08004-002)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31171578)；黑龍江省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃(2011TD005)

陳明明(1988-)，女，山東萊蕪人，在讀碩士生，主要從事植物基因工程研究。E-mail：chenming100210@163.com

朱延明(1955-)，男，黑龍江哈爾濱人，教授，博士，主要從事植物基因工程與分子生物學(xué)研究。 E-mail：ymzhu2001@neau.edu.cn

S816;S551+.703.4;Q943.2

：A

：1001-0629(2014)11-2077-05

10.11829j.issn.1001-0629.2014-0050