炙甘草湯對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子與G-CSF的影響

，，

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610075)

炙甘草湯對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子與G-CSF的影響

馬鵬，張澤淵，劉淵*

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610075)

目的 研究炙甘草湯對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)與G-CSF分泌的影響。方法 選取炙甘草湯與右歸飲2個(gè)方劑,臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞設(shè)空白對(duì)照組、炙甘草湯組、右歸飲組及混合組，每組分別加入相應(yīng)中藥液，于培養(yǎng)第3，6，9天收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA檢測(cè)上清液中TGF-β1與G-CSF的分泌水平。結(jié)果 TGF-β1分泌水平：給藥組均明顯刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β1，與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。實(shí)驗(yàn)初期(第3,6天)炙甘草湯刺激效果較強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)后期(第9天)混合給藥組表現(xiàn)出更好的刺激效果。G-CSF分泌水平：給藥組均明顯刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生G-CSF，與空白對(duì)照組相比，P<0.001?；旌辖o藥組刺激效果最明顯，其次為炙甘草湯組。給藥后細(xì)胞因子分泌均隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加。結(jié)論 炙甘草湯能增強(qiáng)細(xì)胞TGF-β1與G-CSF的分泌，當(dāng)有右歸飲輔助時(shí)這種效應(yīng)更加明顯，其刺激增強(qiáng)作用有時(shí)間累積效應(yīng)，隨時(shí)間延長(zhǎng)TGF-β1與G-CSF的分泌增多。

炙甘草湯;右歸飲;臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1);G-CSF

炙甘草湯是《傷寒論》中陰陽(yáng)并補(bǔ)的代表方。當(dāng)前對(duì)炙甘草湯多局限于抗心律失常的研究，并將該方作為抗心律失常的專方[1]。炙甘草湯以人參、炙甘草、大棗補(bǔ)益心氣；以桂枝、生姜、清酒溫通心陽(yáng)；以生地黃、麥冬、麻仁滋心陰；以阿膠補(bǔ)心血。從整體結(jié)構(gòu)看，該方是一首補(bǔ)心氣、溫心陽(yáng)、滋心陰、養(yǎng)心血而四補(bǔ)心之氣、陽(yáng)、陰、血的平補(bǔ)方[2]。但從方中各藥用量深入分析，則知主要是以重滋陰血為特點(diǎn)。中醫(yī)認(rèn)為“心主血脈”，心通過(guò)“化赤”等作用參與血生成，清代名醫(yī)唐宗海把炙甘草湯作為心參與生血的代表方，臨床上也不乏通過(guò)中藥加強(qiáng)血生成的報(bào)道?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞直接與血液接觸，可通過(guò)多種細(xì)胞途徑參與血細(xì)胞發(fā)生增殖，凝血，炎性細(xì)胞遷移等多種生理或病理過(guò)程。本研究以炙甘草湯為主方，同時(shí)添加右歸飲作為輔助方劑，在體外環(huán)境下刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，研究炙甘草湯對(duì)血液生成的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物與試劑 炙甘草湯：炙甘草、桂枝、人參、生地黃、麥門(mén)冬、麻仁、大棗、生姜、阿膠；右歸飲：熟地黃、山藥、山茱萸、枸杞子、甘草、杜仲、肉桂、制附子，所有中藥均購(gòu)自北京同仁堂。中藥煎煮后進(jìn)行過(guò)濾除渣、高溫滅菌，每1 mL藥液含生藥0.2 g。

DMEM培養(yǎng)基(GIBCO),FBS(GIBCO),谷氨酰胺(GIBCO)，六孔培養(yǎng)板(Corning),0.25% Trypsin-EDTA(GIBCO)，TGF-β1 ELISA試劑盒(達(dá)科為)，G-CSF ELISA試劑盒(CUSABIO)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞分為空白對(duì)照組(只加基本培養(yǎng)基，不加中藥液)、右歸飲組、炙甘草湯組及混合組(添加炙甘草湯與右歸飲)，每組樣本數(shù)為10。培養(yǎng)第3,6,9天收取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，1 000 r/min，離心15 min，后分裝-20 ℃保存。

1.4 ELISA檢測(cè) 1)TGF-β1檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)前將各試劑放至室溫平衡30 min，將樣品置于80 ℃水浴8 min進(jìn)行活化，取出后冷卻5 min，計(jì)算樣品孔及標(biāo)準(zhǔn)品孔數(shù)，100 μL/孔在相應(yīng)孔中加入待測(cè)樣品及標(biāo)準(zhǔn)品，搖勻，封膜后于室溫孵育2 h,吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入生物素標(biāo)記抗體工作液100 μL,室溫孵育2 h，棄去孔內(nèi)液體，洗板3次，每孔加入辣根過(guò)氧化物酶親和素標(biāo)記工作液100 μL，室溫孵育30 min，洗板，加入顯色液，顯色終止后酶標(biāo)儀讀取450 nm處OD值。2)G-CSF檢測(cè):實(shí)驗(yàn)前將各試劑放至室溫平衡30 min，計(jì)算樣品孔及標(biāo)準(zhǔn)品孔數(shù)，100 μL/孔在相應(yīng)孔中加入待測(cè)樣品及標(biāo)準(zhǔn)品，搖勻，封膜后于37 ℃孵育2 h，吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入生物素標(biāo)記抗體工作液100 μL，37 ℃孵育1 h，棄去孔內(nèi)液體，洗板3次，每孔加入辣根過(guò)氧化物酶親和素標(biāo)記工作液100 μL，37 ℃孵育1 h,洗板，加入顯色液，顯色終止后酶標(biāo)儀讀取450 nm處OD值。

2 結(jié)果

2.1 炙甘草湯、右歸飲刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌TGF-β1 實(shí)驗(yàn)第3，6，9天,細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β1的表達(dá)水平在3個(gè)給藥組中均明顯高于對(duì)照組，見(jiàn)表1，P<0.01，表明3個(gè)給藥組均明顯刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β1。在3個(gè)給藥組之間,在第3，6天組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在第9天差異不明顯,具體表現(xiàn)為炙甘草湯單獨(dú)作用時(shí)對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的刺激作用更加明顯，與混合給藥時(shí)相比，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;炙甘草湯組與右歸飲組差異不明顯。第9天雖各給藥組之間差異不明顯,但混合給藥組TGF-β1的表達(dá)量由最初較低水平發(fā)展為略高于另外2個(gè)給藥組水平。

組 別第3天第6天第9天對(duì)照組 227．7±3．7 257．7±2．6 274．4±6．1 右歸飲加炙甘草湯組508．5±30．5## 730．4±4．7## 1554．9±10．4##右歸飲組 593．8±10．3## 934．6±33．9## 1506．9±34．3##炙甘草湯組 691．5±42．9##△1268．5±41．3##△1447．6±3．4##

注：與對(duì)照組比較，##P<0.001；與混合給藥組比較，△P<0.05

2.2 炙甘草湯、右歸飲刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌G-CSF 實(shí)驗(yàn)整個(gè)過(guò)程中在空白對(duì)照組中均未檢測(cè)到G-CSF的表達(dá)，而在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中隨著時(shí)間的增加，在3個(gè)給藥組中均檢測(cè)到增加的G-CSF表達(dá)，見(jiàn)表2。在第3天3個(gè)給藥組之間G-CSF表達(dá)，P<0.01，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第6天混合給藥組G-CSF水平明顯高于另外2個(gè)單獨(dú)給藥組，單獨(dú)給藥組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第9天混合給藥組G-CSF水平明顯高于單獨(dú)給藥組，P<0.01；炙甘草湯組與右歸飲組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 中藥方劑對(duì)G-CSF表達(dá)水平的影響 ng/mL

注：與對(duì)照組比較，##P<0.01；與混合給藥組比較，△△P<0.01

3 討論

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子家族的重要成員,因其能在表皮生長(zhǎng)因子存在的條件下刺激成纖維細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化而得名。TGF-β1具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、遷移、免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞外間質(zhì)形成等作用。大量研究[3]結(jié)果表明，TGF-β1在體內(nèi)腫瘤、遺傳性毛細(xì)血管擴(kuò)張性出血癥、纖維化性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病過(guò)程中都起著重要的作用，因而近年來(lái)越來(lái)越受到關(guān)注。TGF-β1對(duì)細(xì)胞的增殖具有正負(fù)雙向重調(diào)節(jié)作用。在體外能夠抑制較原始的造血祖細(xì)胞從靜止期進(jìn)入增殖循環(huán)，而且這種作用是可逆的[4]。近年來(lái)研究[5]顯示，在體外擴(kuò)增培養(yǎng)中加入30～300 pg/mL的TGF-β1能夠明顯的上調(diào)原始造血干、祖細(xì)胞表面標(biāo)記CD34,促進(jìn)造血祖細(xì)胞的增殖和維持。

G-CSF作為粒細(xì)胞集落刺激因子廣泛用于粒細(xì)胞減少和粒細(xì)胞缺乏的病人，G-CSF主要作用于中性粒細(xì)胞系(lineage)造血細(xì)胞的增殖、分化和活化,重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)作用于造血祖細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和分化,其重要作用是刺激粒、單核巨噬細(xì)胞成熟，促進(jìn)成熟細(xì)胞向外周血釋放，并能促進(jìn)巨噬細(xì)胞及噬酸性細(xì)胞的多種功能。G-CSF還具有促進(jìn)BM中造血干祖細(xì)胞進(jìn)入PB和免疫調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)廣泛用于HSCT中造血干細(xì)胞動(dòng)員。在allo-HSCT中，G-CSF能改變T細(xì)胞亞群，促使T細(xì)胞向Th2細(xì)胞極化[6]，促進(jìn)Treg細(xì)胞的增殖[7]，增加移植物中DC細(xì)胞數(shù)量[8]。

綜合文獻(xiàn)報(bào)道，2種細(xì)胞因子在造血相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用，本實(shí)驗(yàn)重在探討中藥方劑對(duì)2種細(xì)胞因子的刺激作用以驗(yàn)證中藥方劑在造血疾病中的治療作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在TGF-β1分泌方面,2種中藥單獨(dú)或混合作用均能明顯刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β1細(xì)胞因子，在實(shí)驗(yàn)初期炙甘草湯單獨(dú)作用時(shí)刺激效果更加明顯，隨著時(shí)間延長(zhǎng)混合給藥組刺激作用凸顯，細(xì)胞因子的表達(dá)水平超過(guò)單獨(dú)給藥組，并且在3種給藥組中隨著時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞因子分泌量增加，說(shuō)明長(zhǎng)期用藥時(shí)2種中藥混合作用效果更佳，若短期服用可單獨(dú)服用炙甘草湯中藥。在G-CSF分泌方面，空白對(duì)照組未檢測(cè)到G-CSF的分泌,3個(gè)給藥組能明顯檢測(cè)到G-CSF的分泌，并且也表現(xiàn)出隨時(shí)間延長(zhǎng)而分泌增加的現(xiàn)象，在實(shí)驗(yàn)初期(第3天)各給藥組能檢測(cè)到G-CSF分泌，給藥組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；至第6,9天，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)混合給藥組G-CSF因子水平明顯高于2個(gè)單獨(dú)給藥組，說(shuō)明混合給藥組對(duì)G-CSF的刺激更加強(qiáng)烈，在臨床實(shí)踐中,可混合服用以增強(qiáng)療效。綜合2種細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，炙甘草湯中藥方劑能明顯刺激生血作用,當(dāng)有右歸飲輔助作用時(shí)效果更強(qiáng)，混合給藥長(zhǎng)時(shí)間治療會(huì)更加有利于藥效發(fā)揮且能達(dá)到更好治療效果。

[1]王愛(ài)明.炙甘草湯治療心律失常的臨床思路[J].吉林中醫(yī)藥,2007,27(7):9-10.

[2]齊方洲,朱慧芳,徐遼寅,等.炙甘草湯新論[J].吉林中醫(yī)藥,2009,29(9):811-812.

[3]李紅.TGF-β1對(duì)原代培養(yǎng)豬甲狀腺細(xì)胞TPO表達(dá)的影響[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)工程,2011,19(1):17-20.

[4]Grzegorzewski K,Ruscetti F W,Usui N,et al.Recombinant transforming growth factor beta 1 and beta 2 protect mice from acutely lethal doses of 5-fluorouracil and doxorubicin[J].The Journal of experimental medicine,1994,180(3):1047-1057.

[5]Batard P,Monier M N,Fortunel N,et al.TGF-(beta) 1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation[J].Journal of Cell Science,2000,113(3):383-390.

[6]Mielcarek M,Graf L,Johnson G,et al.Production of interleukin-10 by granulocyte colony-stimulating factor-mobilized blood products:a mechanism for monocyte-mediated suppression of T-cell proliferation[J].Blood,1998,92(1):215-222.

[7]Rutella S,Lemoli R M.Regulatory T cells and tolerogenic dendritic cells:from basic biology to clinical applications[J].Immunol Lett,2004,94(1/2):11-26.

[8]Arpinati M,Green C L,Heimfeld S,et al.Granulocyte-colony stimulating factor mobilizes T helper 2-inducing dendritic cells[J].Blood,2000,95(8):2484-2490.

EffectofPreparedLicoriceDecoctiononTGF-β1andG-CSFproductionofumbilicalveinendothelialcells

MA Peng,ZHANG Zeyuan,LIU Yuan*

(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610075,China)

ObjectiveTo investigate the effect ofPreparedLicoriceDecoctionon TGF-β1 and G-CSF production of umbilical vein endothelial cells.MethodsTwo different Chinese herbal medicine prescriptions were used in this research.Umbilical vein endothelial cells were divided into four groups (control group,prepared licorice decoction group,youguiyin group and mixed group).The cell culture supernatant was collected at the 3 rd,6 th,9 th day after herb liquor added into the cell culture system.TGF-β1 and G-CSF level were detected by ELISA.Results1)TGF-β1 production:The TGF-β1 level was higher in all three herb liquor groups than that of control group (P<0.001).The TGF-β1 level ofPreparedLicoriceDecoctiongroup was highest than that of other groups at day 3 and day 6,but the TGF-β1 level was highest in mixed group than that of the other at day 9.2)G-CSF production:The level of G-CSF was higher in all three herb liquor groups than that of control group (P<0.001).The level of G-CSF in mixed group was highest,and then is the level in prepared licorice decoction group.ConclusionThePreparedLicoriceDecoctionn could stimulate umbilical vein endothelial cells secrete higher level of TGF-β1 and G-CSF than control group,and the stimulatory effect was stronger when mixed with youguiyin.The level of TGF-β1 and G-CSF were growing higher as time goes on.

PreparedLicoriceDecoction;Yougui yin;umbilical vein endothelial cell;TGF-β1;G-CSF

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.04.010

國(guó)家自然科學(xué)基金資助：基于“心主血脈”研究炙甘草湯誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞參與造血的機(jī)制(81072728)。

馬 鵬(1980-)，男，碩士研究生。研究方向：歷代名醫(yī)治療難治性血液病的臨床思維及經(jīng)驗(yàn)研究。

] 劉 淵，男，教授，電話：15528044471，電子信箱：liuy60s@sina.com。

R285.5

：A

：2095-6258(2014)04-0590-03

2014-01-28)

*[