血清稀釋與否對(duì)檢測乙型肝炎核心抗體結(jié)果的影響

張碧瑩，邢延芳，王珍珠，耿 丹

(1.銅川市人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，陜西 銅川727000；2.延安大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 延安716000)

乙型肝炎病毒(HBV)感染是世界性公共衛(wèi)生關(guān)注的焦點(diǎn)之一，全球約有3.5億人感染，其中我國感染乙肝病毒的人口約占33%[1]。乙肝病毒血清學(xué)標(biāo)志物檢測是臨床判斷患者傳染性與預(yù)后的重要指標(biāo)。其中HBcAb通常在乙肝表面抗原HBsAg出現(xiàn)后3～5周肝炎癥狀出現(xiàn)前即可在血清中檢出。高濃度的HBcAb陽性常表示乙肝病毒正在復(fù)制，有傳染性。低濃度的HBcAb表示乙肝病毒既往感染，常與HBsAb陽性并存。部分接受血源性疫苗的正常人群，在乙肝表面抗體產(chǎn)生的同時(shí)，HBcAb也會(huì)低濃度存在。其中單項(xiàng)HBcAb陽性，難以確定病人是近期感染，還是既往感染，以及是否具有傳染性，需要進(jìn)一步檢查HBV-DNA的病毒載量。目前我國主要采用ELISA法檢測，HBcAb檢測如做流行病學(xué)調(diào)查，可用原倍血清標(biāo)本直接檢測；如作為臨床診斷依據(jù)，試劑盒使用說明書中建議將待測標(biāo)本用生理鹽水1∶30稀釋后檢測。筆者探討稀釋法檢測過程中，低濃度的HBcAb血清標(biāo)本呈假陰性的情況。以期對(duì)HBcAb檢測方法進(jìn)行優(yōu)化，提高檢測準(zhǔn)確率。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)收集無溶血、無乳糜傳染科血清標(biāo)本1600例，-20℃冰箱保存。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 科美公司全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀，型號(hào)為CHEMCLIN600。中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，型號(hào)為DA7600。

1.2.2 試劑 北京科美生物技術(shù)有限公司HBcAb檢測試劑，批號(hào)為20130427，質(zhì)控液批號(hào)為20130108。中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司HBV-DNA檢測試劑，批號(hào)為2013014。HBV-DNA檢測中值和低值的質(zhì)控液批號(hào)分別為2013003、2013004。選用的全部試劑均在有效使用期限之內(nèi)。檢驗(yàn)工作嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進(jìn)行，所得結(jié)果根據(jù)試劑說明書判斷。

1.3 方法

1.3.1 HBcAb的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)對(duì)原倍血清和按1∶30稀釋的標(biāo)本進(jìn)行HBcAb檢測。

1.3.2 HBcAb的確診 采用電化學(xué)發(fā)光法(Electro Chemiluminescence Immunoassay,ECLI)對(duì)原倍血清和稀釋血清存在差異的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步判斷。

1.3.3 HBV-DNA水平定量檢測 采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(FQ-PCR)。指定HBV-DNA定量以小于1.00×103copies/mL判定為陰性，超過該標(biāo)準(zhǔn)值者則判定為陽性。

2 結(jié)果

2.1 血清稀釋對(duì)檢測乙型肝炎核心抗體結(jié)果存在影響

ELISA法檢測原倍血清標(biāo)本和稀釋血清標(biāo)本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表1)，原倍血清標(biāo)本和稀釋血清標(biāo)本的HBcAb均為陽性的有614例，陽性率為38.4%。原倍血清標(biāo)本和稀釋血清標(biāo)本的HBcAb均為陰性的有922例，陰性率為57.6%。原倍血清標(biāo)本的HBcAb呈陽性，而稀釋血清標(biāo)本的HBcAb呈陰性的有64例，占總標(biāo)本的4.0%。

表1 ELISA法檢測原倍血清和稀釋血清的結(jié)果(n=1600)

2.2 電化學(xué)發(fā)光法檢測乙肝五項(xiàng)的結(jié)果

采用電化學(xué)發(fā)光法對(duì)HBcAb檢測有差異的64例原倍血清標(biāo)本進(jìn)行乙肝五項(xiàng)檢測，結(jié)果顯示(表2)，原倍血清中存在3例“大三陽”患者，6例“小三陽”患者，10例單項(xiàng)HBcAb陽性，45例接受疫苗注射正常標(biāo)本。”電化學(xué)發(fā)光法與ELISA檢測原倍血清HBcAb陽性結(jié)果一致。

表2 電化學(xué)發(fā)光法檢測乙肝五項(xiàng)(n=64)

2.3 兩種方法檢測稀釋血清標(biāo)本的結(jié)果

選取ELISA測定結(jié)果不一致的稀釋標(biāo)本，即原倍血清標(biāo)本檢測HBcAb呈陽性，而稀釋血清呈陰性的標(biāo)本，共計(jì)64例。經(jīng)FQ-PCR法測定發(fā)現(xiàn)，其中2例標(biāo)本的測定值>1.00×103copies/mL，檢測結(jié)果判定為陽性，62例標(biāo)本的測定值<1.00×103copies/mL，判定為陰性。這是ELISA稀釋法未檢測出的2個(gè)標(biāo)本，漏檢率為3.1%。雖然按1∶30稀釋的血清標(biāo)本與原倍血清標(biāo)本相比，不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在一定程度上會(huì)造成漏診也是值得探討和思考的問題。

3 討論

HBV病毒屬正嗜肝病毒屬，是乙肝病毒性肝炎的病原體?？?HBc是HBcAg的相應(yīng)抗體，也是HBV感染后血清中最早出現(xiàn)的HBV、在人群檢出率最高的標(biāo)志性抗體[2]。其持續(xù)時(shí)間長，甚至終身存在。幾乎所有個(gè)體在接觸HBV后都能產(chǎn)生抗-HBc，故它是HBV流行病學(xué)調(diào)查的良好指標(biāo)。高濃度的抗-HBc見于急、慢性肝炎和HBsAg 攜帶者，并表明HBV復(fù)制可能仍活躍，血清具有傳染性。低濃度的抗-HBc則表示既往感染過HBV，一般無傳染性?？?HBc不是保護(hù)性抗體，一些資料和研究表明其可調(diào)節(jié)感染肝細(xì)胞表面HBsAg 表達(dá)，從而影響殺傷性T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的影響。臨床上還常遇到單項(xiàng)HBcAb陽性的情況(0.9%-11.9 %) 其原因有：(1)急性感染恢復(fù)的早期，HBsAg減少或消失，而抗-HBc 尚未產(chǎn)生，即所謂的“窗口期”。(2)被動(dòng)獲得的抗-HBc(母嬰傳播)。(3)遠(yuǎn)期感染伴抗-HBc消失。(4)遠(yuǎn)期感染伴低水平HBsAg。抗-HBc陽性有助于發(fā)現(xiàn)HBsAg陰性的HBV感染者和攜帶者，有助于獻(xiàn)血員的篩查，以確保臨床用血安全，有助于確診處于窗口期的急性乙型肝炎[3]。因此，正確報(bào)告HBcAb的結(jié)果顯得尤為重要[4]。

對(duì)于抗-HBc的ELISA檢測存在一個(gè)常見問題，即以ELISA為方法學(xué)原理的試劑盒說明書采用1∶30的稀釋血清標(biāo)本檢測HBcAb，這是基于普遍認(rèn)為檢測原倍血清標(biāo)本作為流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，而將待測血清標(biāo)本1：30稀釋后檢測作為臨床診斷依據(jù)，其理論依據(jù)是不充分的。如此造成一定程度的漏檢，可能與標(biāo)本稀釋倍數(shù)偏高有關(guān)[5]。本研究結(jié)果表明，有差異的64例原倍血清樣本，經(jīng)ELISA法和電化學(xué)發(fā)光法檢測，兩種方法檢測的陽性率吻合。原倍血清按1:30稀釋后，HBcAb檢測陰性的標(biāo)本再用PQ-PCR檢測，檢出2例HBV-DNA陽性的標(biāo)本，分別對(duì)應(yīng)“大三陽”和單項(xiàng)HBcAb陽性的兩個(gè)標(biāo)本。稀釋法檢測HBcAb假陰性的問題易造成單項(xiàng)HBcAb陽性的患者漏診。這對(duì)臨床確診、獻(xiàn)血員篩選以及院內(nèi)感染的監(jiān)控可能造成影響。因此，在實(shí)際工作中，結(jié)合HBV-DNA檢測十分必要。

血清HBV-DNA水平是判斷HBV復(fù)制活動(dòng)最直接和最可靠的標(biāo)志，其定量檢測對(duì)于了解HBV感染者的傳染性和正確判斷抗病毒治療療效具有重大意義[6]。2009年全國702家醫(yī)療機(jī)構(gòu)參加衛(wèi)生部質(zhì)評(píng)活動(dòng)的結(jié)果表明[7]，HBV-DNA準(zhǔn)確率>99%，免疫靜默感染以及罕見的亞型與變異，是HBV-DNA低濃度感染者被漏檢的原因[8]，故檢測HBV-DNA具有實(shí)際意義，但HBV-DNA檢查作為常規(guī)項(xiàng)目還需要不斷探索。ELISA法和電化學(xué)發(fā)光法是目前常用的方法，但不能全面了解HBV感染及活動(dòng)狀態(tài)。臨床上已普遍認(rèn)可，PCR檢測HBV-DNA能真實(shí)反映HBV在體內(nèi)復(fù)制與傳染性。HBsAg濃度低于檢測下限，HBsAg陰性而HBV-DNA陽性的檢測結(jié)果會(huì)對(duì)安全輸血造成嚴(yán)重威脅，目前防止輸血傳播乙肝的唯一措施是檢測HBsAg。HBcAb檢出比HBsAg更敏感，高濃度者提示有HBV活動(dòng)感染；低濃度者則可能是HBV感染已恢復(fù)的標(biāo)志。因此準(zhǔn)確檢測HBcAb，結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查，以檢查HBsAg陰性者中HBV的感染。

乙肝標(biāo)志物臨床意義各異，單憑某項(xiàng)指標(biāo)很難全面診斷病情，試劑盒的測定結(jié)果僅作為患者總體臨床評(píng)估的一部分，只有綜合多項(xiàng)指標(biāo)及HBV-DNA的檢查結(jié)果，并結(jié)合臨床情況，才能判斷傳染性的大小和病情的輕重。通過乙肝標(biāo)志物的檢測，還可考察乙肝疫苗接種后的免疫效果，也可作為治療乙型肝炎療效評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。

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