電離輻射對(duì)昆明大鼠背部全厚皮瓣leptin表達(dá)影響的研究

陳一夫，王博蔚，張環(huán)環(huán)，劉志輝，劉春麗

(1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，吉林 長(zhǎng)春130041)

Leptin既是脂肪細(xì)胞分泌的多效細(xì)胞因子，也是一種分泌型的蛋白質(zhì)類(lèi)激素，可以通過(guò)受體介導(dǎo)的信號(hào)途徑發(fā)揮作用，也可通過(guò)自分泌和旁分泌方式直接作用于周?chē)慕M織器官發(fā)揮作用[1-3]。近年來(lái)leptin的研究熱點(diǎn)是其對(duì)傷口促愈作用機(jī)制的研究，開(kāi)放性傷口單獨(dú)外用leptin能明顯縮短傷口愈合時(shí)間(從原來(lái)的5-7 d縮短到3-4 d)。其主要機(jī)制為：參與傷口愈合早期的炎癥反應(yīng)；刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌血管緊張素Ⅱ，促進(jìn)愈合早期的血管收縮；促進(jìn)Ⅰ膠原和Ⅱ膠原的合成；促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，刺激微血管形成，促進(jìn)血管再生；促進(jìn)角化細(xì)胞的有絲分裂，促進(jìn)上皮愈合；誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1和纖維生長(zhǎng)因子(FGF)-β等致轉(zhuǎn)移因子的釋放，通過(guò)細(xì)胞因子之間的相互作用促進(jìn)傷口愈合[4-9]。

Leptin能促進(jìn)單純傷口加速愈合，但其對(duì)于放創(chuàng)復(fù)合傷的愈合是否具有促進(jìn)作用目前尚未知。本研究在于揭示放創(chuàng)復(fù)合傷對(duì)皮瓣組織內(nèi)leptin的表達(dá)影響，從而為運(yùn)用leptin治療放創(chuàng)復(fù)合傷愈合的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

昆明小鼠(購(gòu)自吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，leptin兔抗小鼠多克隆抗體、leptin長(zhǎng)型受體(Ob-Rb)兔抗小鼠多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，PV-9001免疫組化檢測(cè)試劑盒(中杉金橋有限公司)，復(fù)合消化液、抗原修復(fù)液(武漢博士德公司)，DAB顯色試劑盒 及DAB染色增強(qiáng)劑(中杉金橋有限公司)，0.01M的PBS(北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1 放創(chuàng)復(fù)合傷動(dòng)物模型的建立 昆明小鼠，雄性，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)一周后，用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組(D)，創(chuàng)傷組(C)，放射組(F)，放射+創(chuàng)傷組(放創(chuàng)組)(FC)每組24只。水合氯醛腹腔注射麻醉，小鼠背部去毛，將(C)、(FC)組小鼠俯臥于手術(shù)臺(tái)上，碘伏消毒，鋪無(wú)菌巾，設(shè)計(jì)2.5 cm×2.0 cm全厚隨意皮瓣，游離端位于髂棘之上1 cm，蒂設(shè)計(jì)在尾端，創(chuàng)緣各距背部中線兩側(cè)0.5 cm，眼科剪沿劃線區(qū)剪開(kāi)預(yù)備全厚皮瓣，沿創(chuàng)緣原位對(duì)位縫合創(chuàng)口。術(shù)后3天F及FC組采用電子線對(duì)小鼠進(jìn)行局部照射，照射野為矩形，大小為3.5 cm×3.0 cm，照射野外圍比較皮瓣面積外圍均大出0.5 cm。采用瓦里安的電子直線加速器，電子線照射，5Gy。對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠每日進(jìn)行大體觀察，分別于放射后1 d，2 d，3 d處死各組小鼠8只，于皮瓣中軸線上距離蒂部1.5 cm，左右距中軸線0.5 cm處取隨意皮瓣(面積為1.0 cm×1.0 cm)，立即投入4%的多聚甲醛固定常規(guī)脫水包埋，進(jìn)行HE染色及免疫組化。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo) (1)大體觀察。 (2)HE染色，組織學(xué)觀察。(3)免疫組化染色：石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟水化，對(duì)組織切片進(jìn)行Leptin、Ob-Rb免疫組化的染色，操作步驟按照PV-9001免疫組化檢測(cè)試劑盒所提供的進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

(1)創(chuàng)口愈合情況：

各組皮瓣無(wú)潰瘍壞死情況。同一時(shí)間，放創(chuàng)組的滲出較單純創(chuàng)傷多，結(jié)痂面積較單純創(chuàng)傷組大，皮膚質(zhì)地較單純創(chuàng)傷組硬。傷口愈合時(shí)間比較：?jiǎn)渭儎?chuàng)傷組創(chuàng)口愈合時(shí)間大約為4 d-8 d，平均6 d；放創(chuàng)組為9 d-24 d，平均14 d。

(2)毛發(fā)再生情況(見(jiàn)圖1)

毛發(fā)開(kāi)始再生時(shí)間：空白組：1 d-2 d，平均1 d；單純創(chuàng)傷組為2 d-5 d，平均3 d，單純照射組為：6 d-32 d，平均均為8 d，放創(chuàng)組：9 d-30 d，平均12 d。

毛發(fā)完全恢復(fù)時(shí)間：空白對(duì)照組：2 d-5 d，平均4 d；單純創(chuàng)傷組為7 d-14 d，平均9 d；單純照射組為：12 d-40 d，平均18 d，放創(chuàng)組：12 d-40 d，平均25 d。

圖1 毛發(fā)生長(zhǎng)時(shí)間比較

2.2 組織病理學(xué)檢查

單創(chuàng)組可見(jiàn)創(chuàng)傷后0 d-5 d大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和創(chuàng)緣出血，隨時(shí)間延長(zhǎng)，炎癥細(xì)胞數(shù)量減少，肉芽組織增生，上皮延伸，創(chuàng)口愈合。放創(chuàng)組可見(jiàn)：上皮層內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象；有的上皮細(xì)胞出現(xiàn)異型性改變和基底膜消失；照射后3 d-7 d內(nèi)，上皮釘突延長(zhǎng)；7 d后上皮釘突變短或消失；傷口愈合后，上皮變薄，膠原纖維稀疏切排列紊亂。放射組：間質(zhì)中可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要是單核細(xì)胞，膠原纖維變性萎縮，玻璃樣變，整個(gè)上皮層變薄(見(jiàn)圖2)。

圖2 放創(chuàng)組組織病理學(xué)變化

2.3 免疫組化結(jié)果

(1) 免疫組化觀察：

Leptin在角化上皮細(xì)胞及毛囊根鞘中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在基底膜和成纖維細(xì)胞中呈弱陽(yáng)性表達(dá)，在皮脂腺的混合性腺泡的漿液細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。Ob-Rb在細(xì)胞團(tuán)的外層角化細(xì)胞及上皮棘層細(xì)胞的細(xì)胞間橋中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在毛囊的根鞘的內(nèi)外根鞘均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，血管內(nèi)皮細(xì)胞弱陽(yáng)性表達(dá)，在皮脂腺的漿液性腺泡呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，粘液性腺泡不表達(dá)(見(jiàn)圖3、4)。

圖3 leptin在不同部位的表達(dá)情況

圖4 OB-Rb在皮膚不同部位的表達(dá)

(2) 各組間leptin及OB-Rb表達(dá)的差異性比較：免疫組化灰度積分統(tǒng)計(jì)表明，電離輻射后早期(1-3天)，放創(chuàng)組leptin及其受體的表達(dá)明顯增強(qiáng)，其表達(dá)量高于單純創(chuàng)傷組、單純放射組及對(duì)照組；而單純創(chuàng)傷組的表達(dá)量明顯強(qiáng)于單純放射組及對(duì)照組；單純放射組強(qiáng)于對(duì)照組(見(jiàn)表1、表2)。

表1 各組間leptin表達(dá)的比較

放射后第1、2、3天組間兩兩比較leptin的灰度積分，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。創(chuàng)傷組，放射組，放創(chuàng)組各組內(nèi)進(jìn)行l(wèi)eptin灰度積分統(tǒng)計(jì)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組間OB-Rb表達(dá)的比較

放射后第1、2、3天組間兩兩比較OB-Rb的灰度積分，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。創(chuàng)傷組，放射組，放創(chuàng)組各組內(nèi)進(jìn)行OB-Rb灰度積分統(tǒng)計(jì)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)黏液性腺泡細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞對(duì)放射線不敏感，若損傷長(zhǎng)期存在，漿液性腺泡細(xì)胞萎縮、消失，導(dǎo)管擴(kuò)張，導(dǎo)管上皮出現(xiàn)鱗狀細(xì)胞化生，間質(zhì)纖維化，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和脂肪組織增生。真皮間質(zhì)膠原呈不同程度水腫，膠原斷裂，少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原纖維裂解，出現(xiàn)玻璃樣變，彈力纖維增多。據(jù)此我們推測(cè)漿液性腺泡是電離輻射的靶細(xì)胞。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在皮膚創(chuàng)傷后早期OB-Rb表達(dá)量降低，第5天起表達(dá)水平迅速上調(diào)。免疫組化在位于傷口邊緣表皮內(nèi)角化細(xì)胞中檢測(cè)到高表達(dá)的OB-Rb，體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)外源性的Leptin可顯著促進(jìn)小鼠或人原代角化細(xì)胞的增殖，而這種刺激效應(yīng)能夠被一種可溶性的無(wú)功能leptin受體所阻斷[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是單創(chuàng)組、單純放射組，還是放創(chuàng)組，在早期leptin及其受體的表達(dá)都顯著上升，尤以放創(chuàng)組更為顯著，這提示放創(chuàng)復(fù)合傷愈合早期，leptin以旁分泌或自分泌的方式參與創(chuàng)傷愈合。

本研究發(fā)現(xiàn)：在放創(chuàng)復(fù)合傷局部，Leptin在角化上皮細(xì)胞及毛囊根鞘中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在基底膜和成纖維細(xì)胞中呈弱陽(yáng)性表達(dá)，在皮脂腺的混合性腺泡的漿液細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。Ob-Rb在細(xì)胞團(tuán)的外層角化細(xì)胞及上皮棘層細(xì)胞的細(xì)胞間橋中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在毛囊的根鞘的內(nèi)外根鞘均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，血管內(nèi)皮細(xì)胞弱陽(yáng)性表達(dá)，在皮脂腺的漿液性腺泡呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，粘液性腺泡不表達(dá)。該結(jié)果提示leptin可能參與調(diào)控毛囊的形態(tài)發(fā)生，且毛囊根鞘很可能是電離輻射作用的靶器官，電離輻射會(huì)導(dǎo)致毛囊根鞘的損傷，因此影響毛發(fā)再生，這與本研究結(jié)論完全相符，雖然電離輻射導(dǎo)致毛囊根鞘局部反饋性調(diào)節(jié)致使leptin及其受體表達(dá)顯著提高，用以加速局部的創(chuàng)傷愈合，但是仍不足以彌補(bǔ)電離輻射所致毛囊根鞘局部創(chuàng)傷修復(fù)細(xì)胞的受損，因此會(huì)導(dǎo)致毛發(fā)再生延遲或減少。這與某些學(xué)者的研究結(jié)論相符，諸如毛囊等上皮結(jié)構(gòu)的發(fā)生可能依賴(lài)于leptin的信號(hào)傳遞，后者通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)復(fù)合物的磷酸化完成[11-12]。

綜上所述，電離輻射會(huì)導(dǎo)致放創(chuàng)復(fù)合傷局部早期Leptin及其受體的表達(dá)明顯升高，尤以漿液性腺泡細(xì)胞及毛囊根鞘顯著，提示漿液性腺泡細(xì)胞及毛囊根鞘作為電離輻射的靶細(xì)胞參與了放創(chuàng)復(fù)合傷的早期愈合，通過(guò)正反饋調(diào)節(jié)作用分泌Leptin促進(jìn)放創(chuàng)復(fù)合傷愈合。

作者簡(jiǎn)介：陳一夫(1993-)，男，本科學(xué)歷，研究方向：口腔頜面部創(chuàng)傷修復(fù)與重建。

參考文獻(xiàn)：

[1]Huang L and Li C.Leptin:a multifunctional hormone[J].Cell Res,2000,10(2):81.

[2]Bj?rbaek C and Kahn B B.Leptin signaling in the central nervous system and the periphery[J].Recent Prog Horm Res,2004,59:305.

[3]Hegyi K,Fül?p K,Kovács K,et al.Leptin-induced signal transduction pathways[J].Cell Biol Int,2004,28(3):159.

[4]Wellhoener P,Fruehwald-Schultes B,Kern W,et al.Glucose metabolism rather than insulin is a main determinant of leptin secretion in humans[J].Clin Endocrinol Metab,2000,85(3):1267.

[5]Mouzaki A,Panagoulias I,Dervilli Z,et al.Expression patterns of leptin receptor (OB-R) isoforms and direct in vitro effects of recombinant leptin on OB-R,leptin expression and cytokine secretion by human hematopoietic malignant cells[J].Cytokine,2009,48(3):203.

[6]Chatzantoni K,Papathanassopoulos P,Gourzoulidou E,et al.Leptin and its soluble receptor in plasma of patients suffering from remitting-relapsing multiple sclerosis (MS) In vitro effects of leptin on type-1 and type-2 cytokine secretion by peripheral blood mononuclear cells,T-cells and monocytes of MS patients[J].Autoimmun,2004,23(2):169.

[7]Wong CK,Cheung PF,Lam CW.Leptin-mediated cytokine release and migration of eosinophils:implications for immunopathophysiology of allergic inflammation[J].Eur J Immunol,2007,37(8):2337.

[8]Rodríguez L,Graniel J,Ortiz R.Effect of leptin on activation and cytokine synthesis in peripheral blood lymphocytes of malnourished infected children[J].Clin Exp Immunol,2007,148(3):478.

[9]Gómez Abellán P,Gómez Santos C,Madrid JA,et al.Site-specific circadian expression of leptin and its receptor in human adipose tissue[J].Nutr Hosp,2011,26(6):1394.

[10]Takahashi H,Honma M,Ishida-Yamamoto A,et al.Adiponectin and leptin modulate cell proliferation and cytokine secretion of normal human keratinocytes and T lymphocytes[J].Dermatol Sci,2010,59(2):143.

[11]Mouzaki A,Panagoulias I,Dervilli Z,et al.Expression patterns of leptin receptor (OB-R) isoforms and direct in vitro effects of recombinant leptin on OB-R,leptin expression and cytokine secretion by human hematopoietic malignant cells [J].Cytokine,2009,48(3):203.

[12]Gorska E,Popko K,Stelmaszczyk-Emmel A,et al.Leptin receptors[J].Eur J Med Res，2010,15 (2):50.