溶藻弧菌動物感染模型的建立及藥敏試驗(yàn)分析

劉曉斐，張河林，胡志德，曹 源，胡成進(jìn)

(濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)診斷科，山東 濟(jì)南250031)

溶藻弧菌是海洋弧菌科中數(shù)量最多的革蘭氏陰性致病菌，廣泛分布于世界各地海域和口岸處，易引起海洋作業(yè)人員傷口海水浸泡感染、中耳炎、眼內(nèi)炎、胃腸炎、食物中毒和敗血癥等疾病[1-4]。由于其致病特點(diǎn)不同于陸地致病菌，其感染規(guī)律及致病機(jī)制尚不明確，感染后表型及代謝特征復(fù)雜多變導(dǎo)致了臨床鑒定困難、不能及時(shí)救治等許多問題。溶藻弧菌感染主要發(fā)生在夏季，但隨著全球變暖的趨勢，溶藻弧菌感染的季節(jié)范圍逐年擴(kuò)大[4]。因此，海洋溶藻弧菌越來越受到人們關(guān)注。

到目前為止，海洋溶藻弧菌感染致病機(jī)制的研究模型多局限于海洋動物，如赤鯛[5]、魚[6]、石斑魚[7]、鮑魚[8]等，而對于陸地哺乳動物感染研究較少，對于人類感染的研究僅停步在流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)及病例報(bào)道，深入機(jī)制研究較少，并且可參考的動物感染模型甚少。因此，本實(shí)驗(yàn)建立了溶藻弧菌腹腔注射感染昆明小鼠模型，并對感染后小鼠尾血分離株進(jìn)行抗菌藥物敏感性分析，為臨床上溶藻弧菌感染治療中的合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株與實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)菌株：溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)菌株購自中國海洋微生物菌種保藏管理中心(MCCC)，菌種編號 E0666。

實(shí)驗(yàn)動物：SPF級雌性昆明小鼠6-8周齡，購于山東大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 半數(shù)致死量測定

實(shí)驗(yàn)用健康昆明小鼠暫養(yǎng)2 d無異常情況后，進(jìn)行腹腔注射感染。每組6只，共6組，分組飼養(yǎng)。細(xì)菌在含3%NaCl的堿性蛋白胨水中增菌16-20 h后收集菌懸液，將其濃度調(diào)整為4×1010、2×1010、1010、5×109、109cfu/ml，每個濃度腹腔注射菌液0.1 ml/只，對照組注射等體積無菌堿性蛋白胨水。觀察24 h，并記錄各組小鼠的死亡情況。

1.3 尾血培養(yǎng)

將小鼠固定在小鼠固定器上，露出尾部。將尾部放在50℃的熱水中5分鐘，待尾部充血后用干棉簽擦干，再用75%酒精棉球擦拭小鼠尾部皮膚。待酒精蒸發(fā)后，用無菌剪刀剪去尾尖0.3 cm，拭去第一滴血之后取一滴血于無菌的3.0%NaCl堿性蛋白胨水中，置于37℃恒溫?fù)u床中145次/min過夜培養(yǎng)。

1.4 細(xì)菌鑒定

VITEK 2 Compact微生物自動鑒定儀(法國梅里埃公司產(chǎn)品)采用自動生化鑒定法，GN卡用于溶藻弧菌等革蘭氏陰性菌。每個GN測試卡有64個反應(yīng)孔，其內(nèi)含有干燥培養(yǎng)基，將調(diào)配好的標(biāo)準(zhǔn)濃度菌懸液在充填機(jī)中被里面的負(fù)壓充填到測試卡內(nèi)，經(jīng)封口后，放入測試槽內(nèi)。讀取器每15分鐘判讀卡片一次，測定卡片內(nèi)細(xì)菌在各孔培養(yǎng)基內(nèi)生長變化值，以生長動力學(xué)方式記錄并決定結(jié)果，確保最佳報(bào)告結(jié)果時(shí)間。從平板上挑取單個菌落，用干燥無菌試管裝3 ml無菌生理鹽水在細(xì)菌比濁儀上配成0.5～0.62 MCF的菌懸液，按順序放在卡架上，取出卡片后將吸管插入到試管中并固定在卡架上，放入填充窗。然后在VITEK 2 Compact微生物自動鑒定儀上按程序自動化完成填充、封口、上卡、卸卡，取出卡架，最后輸入編號后保存。

1.5 藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)，藥敏紙片為英 國 Oxiod公 司 產(chǎn) 品，實(shí)驗(yàn)條件為：MH 平板，菌落懸液為 0.5 麥?zhǔn)蠁挝唬?5℃恒溫培養(yǎng)16-20 h，測量抑菌圈直徑大小，再根據(jù)藥敏試驗(yàn)抑菌圈直徑數(shù)據(jù)和2012CLSI的M45規(guī)則判斷對各種抗菌藥物的敏感性。標(biāo)準(zhǔn)分為3個等級：敏感(S)、中度敏感(M)、耐藥(R)。敏感和中度敏感可合稱為敏感。質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923由本科室的臨床微生物室提供。

2 結(jié)果

2.1 昆明小鼠感染后的一般情況

感染組注射溶藻弧菌菌液3 h后開始出現(xiàn)不同程度的毛發(fā)豎立、腹部顫抖、呼吸急促、背弓、蜷縮少動、進(jìn)食減少等情況，癥狀的輕重與注射的菌量成正相關(guān)。對照組精神狀態(tài)良好，無上述癥狀，無死亡。

2.2 半數(shù)致死量(LD50)

為篩選溶藻弧菌腹腔注射感染小鼠的最適菌量及感染時(shí)間，我們采用了半數(shù)致死量實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表1所示，當(dāng)腹腔感染菌量為4×109cfu時(shí)，昆明小鼠死亡率為100%，平均存活時(shí)間為13.5 h。隨著感染菌量的降低，小鼠死亡率也逐漸降低，存活時(shí)間延長。當(dāng)感染菌量為109cfu時(shí)，小鼠死亡率降到50%。結(jié)果說明，溶藻弧菌E0666株感染昆明小鼠的半數(shù)致死量為109cfu，平均存活時(shí)間是20 h。

表1 溶藻弧菌E0666株腹腔注射感染昆明小鼠的半數(shù)致死量檢測

2.3 小鼠尾血細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定

為確定感染效果，我們在感染后2 h從4×109組中取小鼠尾血進(jìn)行血液培養(yǎng)，37℃恒溫?fù)u床過夜培養(yǎng)后觀察，如圖1A所示,培養(yǎng)基渾濁，說明培養(yǎng)陽性。取少量培養(yǎng)液革蘭氏染色后在油鏡下觀察形態(tài)如圖1B所示，并經(jīng)過VITEK2 Compact微生物自動鑒定儀鑒定為溶藻弧菌。結(jié)果說明，從尾血中分離出的溶藻弧菌來自于腹腔注射的溶藻弧菌，并且溶藻弧菌可以通過腹膜進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，導(dǎo)致菌血癥或敗血癥。

A:尾血液體培養(yǎng) B:細(xì)菌鏡下形態(tài)

2.4 動物分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

為了評價(jià)溶藻弧菌對常用抗菌藥物的敏感性，我們采用了紙片法，對溶藻弧菌動物分離株做了藥敏指南上21種抗菌藥物的敏感性實(shí)驗(yàn)，用精密游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確量取藥敏紙片周圍透明抑菌環(huán)直徑的大小，根據(jù)2012版的CLSI-M45來判斷溶藻弧菌對抗生素的敏感性，三株質(zhì)控菌株的藥敏結(jié)果(抑菌環(huán)直徑)都在質(zhì)控范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分離株對臨床常用的大多數(shù)抗生素敏感，但對氨芐西林和頭孢噻吩耐藥，見表2。

表2 溶藻弧菌動物分離株對臨床常用藥物敏感性

?R：耐藥；S：敏感

3 討論

隨著人們對海洋資源的開發(fā)和利用，海洋致病菌引起的疾病也隨之引發(fā)人們關(guān)注。溶藻弧菌對于海洋生物的危害性早已得到共識，隨著沿海地區(qū)散發(fā)臨床病例報(bào)道，其對于人類的致病性也逐漸得到認(rèn)同。目前，溶藻弧菌的致病機(jī)制研究僅限于海洋動物，缺乏對陸地哺乳動物的研究，并且尚無可用于研究的哺乳動物模型。致病性弧菌屬中以霍亂、副溶血、創(chuàng)傷弧菌感染動物模型報(bào)道較多，多采用口服灌胃、創(chuàng)傷感染或腹腔注射等方式。因此，本實(shí)驗(yàn)首先建立了溶藻弧菌腹腔注射感染小鼠動物模型，得到溶藻弧菌E0666菌株的半數(shù)致死量為109cfu，平均存活時(shí)間為20 h。并且通過對尾血的細(xì)菌培養(yǎng)及鏡下形態(tài)學(xué)觀察、VITEK2 Compact微生物自動鑒定儀鑒定后確定了模型建立成功。該模型的建立對于研究溶藻弧菌的致病機(jī)制及疫苗預(yù)防等具有重要意義，為后續(xù)建立多種感染途徑動物模型打下基礎(chǔ)。

目前對于溶藻弧菌的藥敏試驗(yàn)研究大多取自海水或海洋生物分離培養(yǎng)菌株[9]，細(xì)菌的致病性及代表性不強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)從感染小鼠的尾血中分離培養(yǎng)出動物適應(yīng)株，對其抗生素敏感性進(jìn)行檢測。研究發(fā)現(xiàn)，該菌株對于臨床上大多數(shù)抗生素敏感，但對氨芐西林和頭孢噻吩耐藥性很高。結(jié)果提示臨床應(yīng)注意用藥，避免抗藥性的產(chǎn)生和耐藥菌株的傳播。

總之，溶藻弧菌已成為我國沿海地區(qū)散發(fā)性腹瀉和食物中毒的重要病原菌之一，對于駐島人員和海上訓(xùn)練及作業(yè)人員具有潛在的致病危險(xiǎn)。因此，開展海洋溶藻弧菌的致病機(jī)制研究和藥敏試驗(yàn)研究對致病性弧菌所致疾病的防治具有重要意義。

作者簡介：劉曉斐(1984-)，女，博士，主管技師，主要研究方向?yàn)橹匾≡闹虏C(jī)制研究。

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