高速逆流色譜法分離純化丹參中丹酚酸B和迷迭香酸

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(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

丹參為唇形科植物SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根，具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛、清心除煩的藥效[1].丹參的化學(xué)成分主要為水溶性的丹酚酸類與脂溶性的丹參酮類.丹酚酸B具有強烈的抗氧化和清除氧自由基的活性[2-4]，2010版中國藥典將丹酚酸B作為丹參的指標成分[1].迷迭香酸是一種天然抗氧化劑，具有抗炎抗氧化等活性[5].在中藥研究的過程中[6-7]，制備高純度的單體化合物對中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的深入研究具有十分重要的意義.高速逆流色譜(High-speed counter-current chromatography)作為一種新型液液分配色譜技術(shù)，使用液相作為載體，因此有效避免了固體載體吸附、樣品損失等缺點.由于HSCCC具有制備量大、回收率高等優(yōu)點，近年來廣泛應(yīng)用于中藥活性成分的制備分離[8-10].研究應(yīng)用HSCCC分離制備中藥丹參中的丹酚酸B與迷迭香酸，以期為丹參有效成分的制備提供快速簡便的方法.

1 儀器與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，色譜柱為Phenomenex Gemini C18鍵合硅膠柱(250 mm×4.60 mm，5 μm)；TBE-300A高速逆流色譜儀(上海同田生化技術(shù)有限公司)；N2000色譜工作站(浙江大學(xué)智達信息工程有限公司)；恒流泵(北京圣益通技術(shù)開發(fā)有限公司)；紫外檢測器(上海同田生化技術(shù)有限公司)；恒溫循環(huán)器(北京德天佑科技發(fā)展有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)；Bruker AVANCE Ⅲ型磁共振波譜儀(TMS為內(nèi)標，瑞士Bruker公司，500 MHz).

HSCCC分離用溶劑(正丁醇、乙酸乙酯等)為分析純.HPLC用試劑甲醇、乙腈為色譜純(美國Tedia).中藥材丹參，購于藥店，由楚楚博士鑒定為SalviamiltiorrhizaBge，留樣保存于浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院.

2 實驗方法

2.1 HPLC分析條件

色譜柱Phenomenex Gemini C18柱(250 mm×4.60 mm，5 μm)，流動相為V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(甲酸)∶V(水)=30∶10∶1∶59；柱溫30 ℃，體積流量0.5 mL/min，檢測波長282 nm[1].

2.2 樣品處理

2.2.1 提 取

丹參藥材粉碎，過60目篩，稱取粉末100 g以50%乙醇溶液為提取溶劑，料液比1∶10，加熱回流提取3次，每次1 h，過濾，合并濾液并濃縮.

2.2.2 預(yù)純化

將提取濃縮物用乙酸乙酯萃取，旋去溶劑.取乙酸乙酯萃取物10 g用AB-8大孔吸附樹脂進行初步分離，上樣后靜置2～3 h，待樹脂充分吸附后，用水洗脫至洗脫液無色，棄去，再分別用6 BV的10%乙醇，30%乙醇，40%乙醇，50%乙醇，60%乙醇，95%乙醇溶液進行梯度洗脫，體積流量3 BV/h，收集洗脫液，回收乙醇，干燥.用HPLC檢測洗脫液，將含有目標成分的部分冷凍干燥，用于HSCCC進一步分離純化.

2.2.3 HSCCC溶劑體系的選擇

溶劑體系是HSCCC成功分離的關(guān)鍵.本研究通過測定丹酚酸B在不同溶劑體系中的分配系數(shù)K從而優(yōu)選出合適的溶劑體系.具體操作：將不同溶劑按照一定比例配制，充分混勻，靜置平衡后取經(jīng)預(yù)純化得到的粗品用2 mL上相與2 mL下相的混合液溶解，震蕩靜置分層后，分別各取10 μL上相、10 μL下相用HPLC進行測定，上相的峰面積記為A1，下相的峰面積記為A2，則分配系數(shù)K=A1/A2.

2.2.4 HSCCC分離制備

選擇V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)∶V(水)=3∶7∶1∶9作為溶劑體系進行分離.將選好的溶劑體系按比例配制，充分混勻后在分液漏斗中靜置分層，待兩相平衡后，將兩相分別放入棕色試劑瓶中，超聲脫氣20 min后，將固定相(上相)首先泵入HSCCC的分離管中，待上相將整個分離管充滿后，開啟主機，設(shè)定轉(zhuǎn)速為800 r/min，待轉(zhuǎn)速穩(wěn)定后，將流動相(下相)以1.8 mL/min的體積流量泵入分離管.等到兩相平衡后，稱取經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂吸附分離獲得的粗品161 mg，用等體積的上相與下相各5 mL超聲溶解，從進樣口加入.紫外檢測器波長設(shè)定為280 nm，利用自動收集器收集流出液.

2.3 單體化合物的鑒定及質(zhì)量分數(shù)檢測

采用1H NMR與13C NMR鑒定得到的化合物.用HPLC檢測，面積歸一化法確定其質(zhì)量分數(shù).

3 結(jié)果與討論

3.1 提取物的預(yù)純化

丹參提取液的乙酸乙酯萃取物，經(jīng)過AB-8大孔吸附樹脂吸附后，所含雜質(zhì)減少，目標化合物得到有效初步分離，利于下一步HSCCCC的純化(圖1，2).

圖1 乙酸乙酯萃取部分高效液相色譜圖

圖2 大孔樹脂洗脫部分高效液相色譜圖

3.2 溶劑體系的選擇

HSCCC進行樣品分離的理想溶劑系統(tǒng)分配系數(shù)應(yīng)在0.5～2.0之間[11].若分配系數(shù)過小，則樣品保留時間太短，不能夠達到有效分離；若分配系數(shù)過大，則保留時間過長，致使峰形變寬，整個分離過程延長.本實驗采用HPLC測定樣品在兩相中的分配系數(shù).根據(jù)丹酚酸B在不同溶劑體系中的K值，見表1，選擇V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)∶V(水)=3∶7∶1∶9作為本研究的溶劑體系.

表1 丹酚酸B在不同溶劑體系中的分配系數(shù)

3.3 HSCCC分離

按照選定的溶劑體系進行HSCCC分離，工作站記錄得到的色譜圖見圖3.按照色譜峰減壓干燥得到化合物Ⅰ與Ⅱ.

3.4 產(chǎn)物鑒定及質(zhì)量分數(shù)測定

用高效液相色譜儀檢測其質(zhì)量分數(shù)，面積歸一法，測定化合物Ⅰ與Ⅱ的質(zhì)量分數(shù)分別為98.4%和95.0%(圖4).

圖3 HSCCC分離色譜圖

圖4 化合物的高效液相色譜圖

化合物Ⅰ，(CD3OD，500 MHz，δ)ppm：6.85(1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，7.17(1H，d，J=8.5 Hz，H-6)，7.53(1H，d，J=15.9 Hz，H-7)，6.22(1H，d，J=15.9 Hz，H-8)，6.78(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，6.76(1H，d，J=3.5 Hz，H-5′)，6.65～6.62(1H，m，H-6′)，5.87(1H，d，J=4.8 Hz，H-7′)，4.37(1H，d，J=4.8 Hz，H-8″)，6.75(1H，d，J=2.7 Hz，H-2″)，6.72(1H，d，J=8.0 Hz，H-5″)，6.67(1H，dd，J=2.1，8.2 Hz，H-6″)，2.84(1H，dd，J=9.6，14.3 Hz，H-7″a)，3.03(2H，dd，J=4.5，14.3 Hz，H-7″b，H-7?a)，5.19(2H，dd，J=5.8，12.9 Hz，H-8″，H-8?)，6.53(1H，d，J=1.9 Hz，H-2?)，6.56(1H，d，J=8.0 Hz，H-5?)，6.35～6.30(1H，m，H-6?)，3.09(1H，dd，J=4.1，14.3 Hz，H-7?b).13C NMR(CD3OD，125 MHz，δ)ppm：121.9(C-1)，124.8(C-2)，146.2(C-3)，149.2(C-4)，122.2(C-5)，122.4(C-6)，143.7(C-7)，118.5(C-8)，168.2(C-9)，129.4(C-1′)，117.7(C-2′)，145.4(C-3′)，145.2(C-4′)，117.5(C-5′)，126.5(C-6′)，37.6(C-7′)，74.9(C-8′)，172.4(C-9′)，133.8(C-1″)，118.5(C-2″)，118.5(C-3″)，146.2(C-4″)，146.1(C-5″)，113.5(C-6″)，88.4(C-7″)，58.1(C-8″)，172.4(C-9″)，129.1(C-1?)，116.8(C-2?)，146.9(C-3?)，146.7(C-4?)，116.6(C-5?)，122.2(C-6?)，38.0(C-7?)，75.8(C-8?)，172.4(C-9?).上述波譜數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[12]，可推測該化合物為丹酚酸B.

化合物Ⅱ，1H NMR(CD3OD，500 MHz，δ)ppm：7.06(1H，d，J=1.7 Hz，H-2)，6.96(1H，dd，J=8.2，1.7 Hz，H-5)，6.81～6.76(2H，m，H-6，2′)，7.56(1H，d，J=15.9 Hz，H-7)，6.28(1H，d，J=15.9 Hz，H-8)，6.71(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.63(1H，br d，J=8.0 Hz，H-6′)，3.14～2.96(2H，m，H-7′)，5.18(1H，s，H-8′)；13C NMR(CD3OD，125 MHz，δ)ppm：127.9(C-1)，114.8(C-2)，146.3(C-3)，149.8(C-4)，115.4(C-5)，123.2(C-6)，147.7(C-7)，116.6(C-8)，168.7(C-9)，129.8(C-1′)，117.7(C-2′)，146.9(C-3′)，145.3(C-4′)，116.4(C-5′)，121.9(C-6′)，38.2(C-7)，75.7(C-8′),168.7(C-9′).上述波譜數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[13]，可推測該化合物為迷迭香酸.

4 結(jié) 論

本研究選用V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)∶V(水)=3∶7∶1∶9作為溶劑體系進行HSCCC分離制備丹參中的丹酚酸B與迷迭香酸，丹參藥材經(jīng)過萃取、大孔吸附樹脂吸附，除去部分雜質(zhì)，使得目標化合物得到初步分離，然后將161 mg粗品應(yīng)用制備型HSCCC分離得到丹酚酸B 52.3 mg和迷迭香酸14.5 mg，質(zhì)量分數(shù)分別達到98%與95%以上.結(jié)果表明：與直接利用丹參提取物進行HSCCC分離相比，本方法能夠避免因提取物中存在雜質(zhì)過多致使分離制備得到的樣品質(zhì)量分數(shù)不高的缺點，為丹參有效成分的進一步開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ).

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