電針豐隆穴對高脂血癥大鼠腹腔巨噬細胞MCP-1、IL-1γ 表達的影響*

田佳玉 陳盈芳 王 瓊 肖 穎 樂 薇 張紅星（湖北省武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院，湖北 武漢 430022）

電針豐隆穴對高脂血癥大鼠腹腔巨噬細胞MCP-1、IL-1γ 表達的影響*

田佳玉 陳盈芳 王 瓊 肖 穎 樂 薇 張紅星△（湖北省武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院，湖北 武漢 430022）

目的 觀察電針豐隆穴對高脂血癥大鼠單核趨化因子（MCP-1）、白細胞介素1γ（IL-1γ）含量的影響。方法 將40只健康SD大鼠隨機分為正常對照組、高脂飼料組、高脂+普通飼料組、高脂飼料治療組及高脂+普通飼料治療組，每組8只。正常組喂普通飼料，其余4組采用高脂飲食飼料飼喂法建立高脂血癥大鼠模型，造模28 d后，高脂+普通飼料組、高脂+普通飼料治療組改用普通飼料喂養(yǎng)，其余3組飼喂方法不變，同時高脂飼料治療組及高脂+普通飼料治療組電針豐隆穴，疏密波，頻率為2/100 Hz，電流強度2 mA，治療30 min，每日1次，連續(xù)治療28 d。治療結束后，檢測各組大鼠血脂水平，即總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）含量，流式細胞術（FCM）及酶聯(lián)免疫吸附法（ELASA）檢測各組大鼠腹腔巨噬細胞中單核趨化因子（MCP-1）、白細胞介素1γ（IL-1γ）的表達。結果 高脂飼料組大鼠血漿TC、LDL-C與正常對照組相比明顯上升（P＜0.01）；高脂+普通飼料組大鼠血漿TC、LDL-C與高脂飼料組相比較明顯下降（P＜0.01），較正常對照組仍明顯升高（P＜0.01）；電針豐隆穴治療后，高脂飼料治療組與高脂飼料組相比較，TC和LDL-C明顯降低（P＜0.01），高脂+普通飼料治療組大鼠血漿中TC、LDL-C與高脂+普通飼料組相比較，明顯降低（P＜0.01）。高脂飼料組大鼠腹腔巨噬細胞、MCP-1及IL-1γ的表達較正常對照組顯著升高（P＜0.01）；高脂+普通飼料組大鼠腹腔巨噬細胞、MCP-1及IL-1γ的表達較高脂飼料組明顯下降（P＜0.05），但仍較正常組明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；高脂+普通飼料治療組大鼠腹腔巨噬細胞、MCP-1及IL-1γ的表達較高脂飼料治療組顯著下降（P＜0.01）。結論 電針豐隆穴能夠明顯下調高脂血癥大鼠巨噬細胞、MCP-1、IL-1γ的表達，對高脂血癥具有一定的治療作用。

高脂血癥 電針 豐隆穴 巨噬細胞 單核趨化因子1 白細胞介素1γ

高脂血癥是常見的代謝與內分泌疾病，同時也是動脈粥樣硬化（AS）、冠心?。–HD）等相關疾病的病理基礎，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，嚴重影響人類身體健康［1］。另外，它與心腦血管、腎臟疾病的發(fā)病率、死亡率之間存在著明顯的相關性。目前對高脂血癥的治療，臨床上主要采用他汀類、貝特類、煙酸類及樹脂類等調脂藥物，其調脂作用、力度各不相同，且容易引起肝、腎損害等不良反應［2］。大量的臨床研究表明，針刺作為非藥物療法治療高脂血癥有著無法替代的治療效果［3］。本研究通過觀察電針高脂血癥大鼠的豐隆穴，對其腹腔巨噬細胞、巨噬細胞內單核趨化因子（MCP-1）、白細胞介素1γ（IL-1γ）含量的影響，進一步明確電針在治療高脂血癥中的作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康SD大鼠40只，雄性，體質量180～200 g，由武漢大學實驗動物中心提供，動物合格證號［SCXK（鄂）2008-0004］。根據(jù)隨機數(shù)字表將40只SD大鼠隨機分為5組，每組8只大鼠，即正常對照組、高脂飼料組、高脂飼料治療組、高脂+普通飼料組及高脂+普通飼料治療組。

1.2 主要藥品與儀器 流式細胞儀（美國ABI公司），抗大鼠CD11 b-PERCP單克隆抗體 （美國eBioscience公司），抗大鼠MCP-1-PE單克隆抗體 （美國eBioscience公司），1640培養(yǎng)液，PBS緩沖液（美國HyClone公司），Ionomycin，莫能霉素（美國 ENZO 公司），PMA，皂苷 （美國Amresco公司），0.1%BSA （瑞士Roche公司），多聚甲醛 （美國SIGMA公司），大鼠白介素1γ（IL-1γ）ELISA試劑盒（伊萊瑞特公司），全自動酶標儀 （Thermo scientific實驗室），LH202H型韓氏穴位神經刺激儀（北京華威有限公司），型號S3210 32號1寸健衛(wèi)士牌不銹鋼針灸針 （中美合作泰成科技發(fā)展有限公司）。

1.3 動物造模 正常對照組大鼠用普通大鼠飼料自然喂養(yǎng)，其余4組大鼠用高脂飼料喂養(yǎng)，飼料組成：豬油10%，蛋黃粉5%，膽固醇1%，丙基硫氧嘧啶0.2%，脫氧膽酸鈉0.5%，蔗糖5%，基礎飼料78.3%［4］。喂養(yǎng)28 d后，其中高脂+普通飼料組及高脂+普通飼料治療組換成普通飼料喂養(yǎng)，同時對高脂飼料治療組及高脂+普通飼料治療組大鼠進行電針豐隆穴治療。

1.4 治療方法 取穴參照《實驗針灸學》［5］，模擬人體經穴定位后，選取大鼠雙側豐隆穴。豐隆穴在大鼠膝關節(jié)外側后三里下1 mm，腓骨小頭下約5 mm處。用1寸針灸針，對豐隆穴直刺7 mm，快速捻轉至針下有沉澀感后，接韓式穴位神經刺激儀，調至等幅疏密波，頻率為2/100 Hz，電流強度2 mA，以大鼠肢體微顫為度，每次治療時間為30 min，每日1次，連續(xù)治療28 d。

1.5 血脂檢測 5組大鼠在干預第56日后，均禁食不禁水12 h，經頸動脈用肝素鈉試管采血4～5 mL。標本送至武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院檢驗科，采用Olympus AU2700型全自動生化分析儀，根據(jù)各指標試劑盒說明書，檢測血漿中總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇 （LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）含量。

1.6 流式細胞儀檢測大鼠腹腔巨噬細胞內MCP-1的分子表達水平 （1）提取大鼠腹腔巨噬細胞：參照蘭青等［6］的方法提取SD大鼠腹腔巨噬細胞，具體步驟如下：頸椎脫臼處死大鼠，手提大鼠尾部將全鼠浸入70%酒精中，浸泡5 min后，再將其倒立提出，從大鼠腹腔一側近腹股溝處注射1640培養(yǎng)液30～50 mL，將大鼠仰臥平放并用手指輕揉腹部3 min，靜置5 min后，置大鼠于超凈工作臺上并打開大鼠腹腔，觀察其腸管變扁且腹腔液為淡黃色時，用無菌滴管吸取其腹腔液約10 mL，1200 r/min離心8 min。去上清后，留下離心管底部乳白色沉淀物，繼以1640培養(yǎng)液調整細胞至所需濃度。（2）固定及染色：將分離后的巨噬細胞液加至96孔U 型板，0.2×107/mL， 加入 PMA （5 ng/mL）、ionomycin（500ng/mL）和莫能霉素（Monensin）（終濃度為 2μmol/L）置37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)4 h后收集細胞，PBS洗1次，本實驗中巨噬細胞表面抗原染色用的熒光標記的CD11 b抗體，可與巨噬細胞特異性結合，從而能夠反映出大鼠腹腔巨噬細胞的含量。調整細胞濃度1×10/mL，50 μL細胞加入抗CD11 b抗體，4℃孵育30 min，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定4℃，30 min。PBS洗2次，第2次用含0.1%的皂苷，0.1%BSA的PBS洗細胞，調整細胞濃度 1×107/mL，50 μL 細胞加入 MCP-1 抗體，4℃孵育30 min，PBS洗 2次，PBS重懸細胞至0.3 mL，流式細胞儀檢測。（3）設置流式檢測對照：①空白孔2×105/0.3 mL細胞；②2×105/0.3 mL細胞加CD11 b抗體；③2×105/0.3 mL細胞加MCP-1抗體；④2×105/0.3 mL細胞加CD11 b抗體+MCP-1二標。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附法（ELASA）檢測 檢測大鼠腹腔巨噬細胞中IL-1γ的含量。從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，未用的板條和干燥劑放回鋁箔袋內壓實自封條，密封口袋，4℃，空白孔加標準品標本通用稀釋液，其余相應孔中加標本或不同濃度標準品（100 μL/孔），用封板膠紙封住反應孔，36 ℃孵箱孵育90 min，提前20 min準備生物素化抗體工作液，洗板5次，空白孔加生物素化抗體稀釋液，其余孔加入生物素化抗體工作液（100 μL/孔），用新封板膠紙封住反應孔，36℃孵箱孵育60 min，提前20 min準備酶結合物工作液，避光室溫（22～25℃）放置，洗板5次，空白孔加酶結合物稀釋液，其余孔加入酶結合物工作液（100 μL/孔），用新封板膠紙封住反應。加入顯色底物（TMB）100 μL/孔，避光 36℃孵箱，避光孵育 15 min，加入終止液50 μL/孔，混勻后即刻測量OD450值。將標準品濃度作橫坐標，對應OD值做縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各組樣本濃度值。

1.8 統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，繼以LSD檢驗，計量資料以（±s）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血脂水平的比較 由表1可以看出，高脂飼料組大鼠血漿TC、LDL-C與正常對照組相比明顯上升（P＜0.01），而 TG和 HDL-C無明顯變化（P＞0.05）；高脂+普通飼料組大鼠血漿TC、LDL-C與高脂飼料組相比較明顯降低（P＜0.01），較正常對照組仍明顯升高（P＜0.01）；高脂飼料治療組與高脂飼料組相比較，TC 和 LDL-C 明顯降低（P＜0.01），高脂+普通飼料治療組大鼠血漿中TC、LDL-C與高脂+普通飼料組相比較，明顯降低（P＜0.01），而血漿TG和HDL-C無明顯變化（P＞0.05）。

表1 各組大鼠血脂水平比較（mmol/L，±s）

表1 各組大鼠血脂水平比較（mmol/L，±s）

組 別 n正常對照組 8高脂飼料組 8高脂+普通飼料組 8 TC TG HDL-C LDL-C 1.61±0.33 0.56±0.24 0.84±0.09 0.28±0.08 10.98±3.05** 0.68±0.21 0.62±0.21 5.48±1.06**6.77±1.08**△△ 0.61±0.18 0.65±0.19 2.80±0.64**△△高脂飼料治療組 8 5.12±0.81**△△ 0.58±0.19 0.69±0.15 1.27±0.37*△△高脂+普通飼料治療組 8 3.02±0.38△▲▲ 0.58±0.18 0.72±0.13 0.79±0.49△▲▲

與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與高脂飼料組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與高脂+普通飼料組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。 下同。

2.2 各組大鼠腹腔巨噬細胞含量及細胞內MCP-1的比較 由表2可以看出，高脂飼料組大鼠巨噬細胞含量及巨噬細胞內MCP-1表達率較正常對照組明顯上升（P＜0.01），高脂+普通飼料組大鼠巨噬細胞含量及巨噬細胞內MCP-1表達率較高脂飼料組明顯下降（P＜0.05），較正常組仍明顯上升 （P＜0.05或 P＜0.01），高脂飼料治療組與高脂飼料組相比較，巨噬細胞含量及巨噬細胞內MCP-1表達率明顯下降 （P＜0.01），高脂+普通飼料治療組與高脂+普通飼料組相比較，巨噬細胞含量及巨噬細胞內MCP-1表達率明顯降低（P＜0.01），高脂+普通飼料治療組與高脂飼料治療組比較，巨噬細胞含量及巨噬細胞內MCP-1表達率明顯降低（P＜0.01）。

表2 各組大鼠巨噬細胞含量及巨噬細胞內MCP-1 表達率比較（%，±s）

表2 各組大鼠巨噬細胞含量及巨噬細胞內MCP-1 表達率比較（%，±s）

組 別 n正常對照組 8高脂飼料組 8高脂+普通飼料組 8 CD11b MCP-1 16.29±1.73 2.88±0.42 65.14±3.74** 24.88±5.44**48.73±2.27**△ 13.77±0.87*△高脂飼料治療組 8 36.91±2.54**△△▲▲ 8.43±0.55△△高脂+普通飼料治療組 8 26.49±2.12*△△▲▲ 6.30±0.82*▲▲

2.3 各組大鼠腹腔巨噬細胞中IL-1γ的比較 見表3。結果示高脂飼料組大鼠巨噬細胞內IL-1γ濃度較其余4組顯著上升（P＜0.01），高脂+普通飼料組大鼠巨噬細胞內IL-1γ濃度較正常對照組仍明顯上升 （P＜0.05），高脂飼料治療組較高脂+普通飼料組相比較，IL-1γ濃度顯著降低（P＜0.01），高脂+普通飼料治療組與高脂+普通飼料組及高脂飼料治療組比較，IL-1γ濃度顯著降低（P＜0.01）。

表3 各組大鼠巨噬細胞內IL-1γ濃度比較（nmol/mL，±s）

表3 各組大鼠巨噬細胞內IL-1γ濃度比較（nmol/mL，±s）

組 別 n正常對照組 8高脂飼料組 8高脂+普通飼料組 8 IL-1γ 26.27±1.20 47.10±1.52**40.82±0.84*△高脂飼料治療組 8 35.01±0.64△▲▲高脂+普通飼料治療組 8 30.42.30±0.49△▲

3 討 論

高脂血癥屬于中醫(yī)學“痰濁”、“瘀血”范疇，形成的外因多是由于嗜食肥甘、膏粱厚味，內因主要是脾腎運化輸布不調，肝膽疏泄失暢。因此，高脂血癥與高血壓病、冠心病、腦血管病及肥胖癥關系密切［7-8］。

豐隆穴始見于 《靈樞·根結》，是足陽明胃經的絡穴，功能主要是化痰降濁、健脾通腑，可宣通脾胃兩經的氣機，脾為生痰之源，脾胃若運行正常則痰無所生?！队颀埜琛吩啤疤刀嘁讼蜇S隆尋”，可見豐隆穴為化痰的首選穴。大量實驗表明，中醫(yī)的“痰”與自由基代謝異常有關，而豐隆穴的化痰作用除了能夠調節(jié)血脂代謝，還能夠改善機體的自由基代謝［9］。

高脂血癥的形成主要是由于脂質代謝紊亂。高脂血癥是AS形成最主要的危險因素，而炎癥反應貫穿了AS形成過程的始終［10］。本實驗結果表明，電針豐隆穴治療高脂血癥大鼠后，大鼠血漿TC、LDL-C明顯降低，說明針刺豐隆穴下調血脂的作用是十分顯著的。此外，高脂+普通飼料組大鼠血漿TC、LDL-C較高脂飼料組明顯下降，說明了一定程度的控制高脂飲食對高脂血癥的具有一些干預作用。

血脂代謝的異常與炎癥反應、炎癥細胞因子之間存在著密切的聯(lián)系，單核細胞與內皮細胞的黏附是AS形成的第一個環(huán)節(jié)。單核細胞主要依賴其表面抗原CD11 b與內皮細胞進行黏附。有研究表明［11］，活化的單核細胞上的CD11 b的表達率顯著上升，其在巨噬細胞的黏附、活化過程中發(fā)揮著重要作用，CD11 b表達量的改變能夠反映巨噬細胞的活化狀態(tài)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，機體MCP-1的含量與血漿膽固醇水平有關［12］。MCP-1屬于趨化因子家族中的β家族，主要來源于內皮細胞、單核細胞、巨噬細胞及平滑肌細胞，巨噬細胞在MCP-1的趨化作用下進入炎癥區(qū)；除此之外，MCP-1表達的升高能增強多種細胞因子和黏附分子的表達與合成，能上調單核細胞表面特異性黏附分子CD11 b的表達、激活白細胞黏附分子1的表達以及促進細胞因子IL-1、IL-6產生等作用，從而增強其黏附性而加重了組織損傷［13］；相反IL-1也能誘導MCP-1 mRNA和蛋白的表達，它們通過誘導內皮細胞產生MCP-1，趨化單核細胞進入動脈內膜，從而參與動脈粥樣硬化的形成與發(fā)展［14］。

本實驗提示，高脂飼料組大鼠腹腔巨噬細胞及其內MCP-1及IL-1γ的表達較正常對照組顯著升高（P＜0.01），推測此時高脂血癥大鼠處于炎癥狀態(tài)，其巨噬細胞表達增加，分化變強。高脂+普通飼料組大鼠腹腔巨噬細胞及其內MCP-1及IL-1γ的表達較高脂飼料組明顯下降（P＜0.05），但其仍較正常組明顯升高（P＜0.05），說明一定的飲食控制在治療高脂血癥方面有重要的干預作用，但單純的飲食控制尚有局限［15］，所以仍需結合針灸治療來下調血脂水平。高脂+普通飼料治療組大鼠腹腔巨噬細胞、MCP-1及IL-1γ的表達較高脂飼料治療組顯著下降（P＜0.01），筆者推測電針豐隆穴能夠能抑制大鼠腹腔巨噬細胞MCP-1表達，從而間接影響到IL-1γ的表達，而降低上述炎癥因子的含量，從而減輕了炎癥反應。然而這一過程涉及的機制十分復雜，尚需更深入的研究與探索。

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Effect of Electroacupuncture at Fenglong （ST40） Acupoint on the Expression of MCP-1 and IL-1γ in Macrophages of Hyperlipidemic Rats

TIAN Jiayu，CHEN Yingfang，WANG Qiong，et al.Wuhan University of Traditional Chinese Medicine，Hubei，Wuhan430022，China

Objective:To explore the effect of electroacupuncture at Fenglong （ST40） acupoint on inflammatory factors MCP-1 and IL-1γ of rats with hyperlipemia（HLP）.Methods:40 health SD rats were randomied into normal control group，high fat feed group，high fat+normal feed group，high fat feed treatment group，and high fat+normal feed treatment group，with 8 rats in each group.The high fat feed group was eatablished by feeding the animals with high fat forage for 28 days.After modeling，rats of high fat+normal feed group and high fat+normal feed treatment group were fed bassl forage.EA（2 mA，2 Hz/100 Hz） was applied to bilateral Fenglong（ST40）for 30 min，once daily for 28 days.After electro-acupuncture at Fenglong acupoint for 28 days，blood fat level，total cholesterol（TC），triglyceride（TG），low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C），and high-density lipoprotein cholesterol（HDL-C） were tested.Flow cytometry（FCM） and enzyme-linked immunosorbent assay（ELASA） were applied to observe changes of the expression of MCP-1 and IL-1γ in macrophages of hyperlipidemic rats.Results:The content of TC and LDL-C showed an apparent increase in high fat feed group as compared with normal control group and high fat+normal feed group （P＜0.01）.There were significant reductions in the content of TC and LDL-C after the treatment（P＜0.01）.The expression of MCP-1 and IL-1γ in macrophages of hyperlipidemic rats showed an apparent increase in high fat feed group as compared with normal control group （P＜0.01）and high fat+normal feed group （P＜0.05）and high fat+normal feed group still showed an apparent increase com-pared with normal control group （P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with high fat feed treatment group，the expression of macrophages，MCP-1 and IL-1γ in macrophages of hyperlipidemic rats decreased obviously in high fat+normal feed treatment group.Conclusion:Electro-acupuncture at Fenglong acupoint can not ably decrease the expression of macrophages as well as MCP-1 and IL-1γ in macrophages，thereby it has therapeutical effect on hyperlipemia.

Hyperlipemia；Electroacupuncture；Fenglong（ST40） Acupoint；Macrophages；MCP-1；IL-1γ

R245.9+7

A

1004-745X（2014）07-1212-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.07.002

國家自然科學基金資助項目（30873309）

△通信作者

2014-03-26）