針灸內(nèi)關(guān)預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷兔血清NO、NOS及腺苷含量的影響*

陽(yáng)晶晶 嚴(yán) 潔 王 超△ 常小榮 劉 密

林海波2 謝文娟1 賀香嫦1 張佳麗1 劉 昭1

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.廣東省五邑中醫(yī)院，廣東 江門(mén) 529000）

針灸內(nèi)關(guān)預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷兔血清NO、NOS及腺苷含量的影響*

陽(yáng)晶晶1嚴(yán) 潔1王 超1△常小榮1劉 密1

林海波2謝文娟1賀香嫦1張佳麗1劉 昭1

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.廣東省五邑中醫(yī)院，廣東 江門(mén) 529000）

目的 觀察針灸內(nèi)關(guān)預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷兔血清一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）及腺苷含量的影響。方法 將32只新西蘭大耳白兔隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、電針組和艾灸組。采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支40 min再灌注60 min的方法，建立心肌缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組于末次捆綁結(jié)束48 h后開(kāi)胸，穿線靜置40 min，拔線，繼續(xù)靜置60 min后取材；缺血再灌注組于末次捆綁結(jié)束后48 min行缺血再灌注后取材，電針組和艾灸組分別在針刺、艾灸內(nèi)關(guān)穴之后48 h再行缺血再灌注。高效液相色譜法測(cè)定血清腺苷含量，采用硝酸還原酶化學(xué)比色法檢測(cè)血清NO、NOS的含量。結(jié)果 缺血再灌注組血清NO、NOS及腺苷的含量較假手術(shù)組相比明顯下降（P＜0.05）；電針組與艾灸組血清NO、NOS及腺苷的含量較缺血再灌注模型組相比均明顯升高（P＜0.01），而電針組與艾灸組兩組間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論 電針、艾灸內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理可以提高兔血清中NO、NOS及腺苷的含量，即可以增強(qiáng)延遲性保護(hù)機(jī)制的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中觸發(fā)物質(zhì)NO、NOS、腺苷的活性和含量，表明了針灸預(yù)處理內(nèi)關(guān)穴可以在48 h這一延遲時(shí)相產(chǎn)生針對(duì)缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)作用。

針灸預(yù)處理 心肌缺血再灌注損傷 內(nèi)關(guān) NO NOS 腺苷

目前，缺血性心臟病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，缺血性心血管病占我國(guó)心血管病總發(fā)病數(shù)的65%［1］。缺血性心臟病的治療關(guān)鍵是以恢復(fù)冠脈灌注為核心。研究發(fā)現(xiàn)，冠脈的驟然開(kāi)通與血流恢復(fù)，會(huì)引起心肌缺血再灌注損傷（MIRI）。本課題組早在前期做了大量研究工作，證實(shí)了針灸預(yù)處理能夠通過(guò)多種途徑對(duì)大鼠、家兔MIRI起到保護(hù)作用［2-8］。本實(shí)驗(yàn)以心肌缺血再灌注兔為模型，通過(guò)對(duì)延遲性保護(hù)機(jī)制的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中觸發(fā)物質(zhì)一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、腺苷的活性和含量的比較，觀察針灸內(nèi)關(guān)預(yù)處理對(duì)MIRI的延遲保護(hù)作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源及分組 選用新西蘭大耳白兔共32只，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（清潔級(jí)），每只分籠圈養(yǎng)于動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室。體質(zhì)量1.5～2.5 kg，月齡3～4個(gè)月，雌雄兼用，飼養(yǎng)溫度20～25℃，濕度50%～70%。分組采用完全隨機(jī)方法，將其分為假手術(shù)組，缺血再灌注組，電針組，艾灸組，每組各8只。

1.2 干預(yù)方法 （1）假手術(shù)組。將兔捆綁固定于兔臺(tái)上，每次20 min，每日1次，連續(xù)5 d。于末次捆綁結(jié)束后48 h按缺血再灌注造模的起始流程開(kāi)胸，穿線靜置40 min，拔線，繼續(xù)靜置 60 min后取材。（2）缺血再灌注組。將兔捆綁固定于兔臺(tái)上，每次20 min，每日1次，連續(xù)5 d。于末次捆綁結(jié)束后48 h行缺血再灌注后取材。（3）電針及艾灸組。將兔捆綁固定于兔臺(tái)上之后，相應(yīng)行電針、艾灸預(yù)處理，每次20 min，每日1次，連續(xù)5 d。于末次捆綁結(jié)束后48 h行缺血再灌注后取材。

1.3 模型制備 兔稱(chēng)質(zhì)量后經(jīng)耳緣靜緩慢推注20%烏拉坦（4 mL/kg）作全身麻醉，麻醉成功后繼續(xù)經(jīng)耳緣靜脈緩慢滴入5%葡萄糖注射液。將兔仰位固定在兔臺(tái)上，左胸前區(qū)去毛，碘伏皮膚消毒，鋪無(wú)菌洞巾；將心電圖肢導(dǎo)聯(lián)的針形電極刺于兔皮下，紅色電極與右上肢相連，黃色電極與左上肢相連，綠色電極與左下肢相連，標(biāo)準(zhǔn)電壓為10 mm/mv，走紙速度為50 mm/s；沿胸骨正中線左側(cè)旁開(kāi)1～2 cm處切開(kāi)皮膚，切口約5 cm，顯露肋骨，從第3、4肋間隙處鉗夾預(yù)防出血后，剪斷上下兩肋，以乳突牽開(kāi)器適度撐開(kāi)胸壁，此時(shí)可見(jiàn)心臟；用無(wú)齒鑷夾住已被剪開(kāi)的心包膜，將心臟輕輕向上提起，以左冠狀動(dòng)脈主干為標(biāo)志，再用持針器持無(wú)創(chuàng)性小圓彎針在左冠狀動(dòng)脈前降支上、中1/3交界處穿一根零號(hào)醫(yī)用縫合線，將縫合線兩端套入一直徑為2 mm長(zhǎng)度為3 cm的硅膠管，用止血鉗將硅膠管送入緊貼心壁，連絲線一起夾緊后即為結(jié)扎血管；立即心電圖監(jiān)測(cè)，以左室前壁發(fā)紺及心電圖ST段抬高為缺血達(dá)成的標(biāo)志，合攏胸腔，生理鹽水紗塊覆蓋切口，持續(xù)結(jié)扎40 min后開(kāi)胸，松開(kāi)止血鉗以釋放硅膠管，恢復(fù)左前降支灌流60 min。

1.4 針灸操作 將兔固定于兔臺(tái)上后，電針組采用華佗牌SDZ-Ⅱ型電子針療儀 （蘇州醫(yī)療用品有限公司）電針雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴，直刺入穴位約0.5 cm，行小幅度捻轉(zhuǎn)手法（平補(bǔ)平瀉）1 min后接電針（內(nèi)關(guān)穴接刺激較強(qiáng)的負(fù)極，正極接兔尾部）。刺激參數(shù)：疏密波，疏波10 Hz，密波50 Hz，強(qiáng)度以雙上肢輕微顫動(dòng)為度。艾灸組采用“神灸300灸”艾柱（每壯含艾絨約0.2 g，蘇州東方艾絨廠生產(chǎn)）灸兔雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴，以上均操作時(shí)間20 min，每日1次，共5 d。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 動(dòng)物經(jīng)歷缺血40 min、再灌注60 min后，兔頸部去毛沿氣管正中線切開(kāi)皮膚，將一側(cè)頸動(dòng)脈行鈍性分離，用2支6 mL無(wú)抗凝劑的真空采血管取頸動(dòng)脈血各3 mL，3000 r/min離心10 min分離血清，移液槍分別吸取上清0.5 mL至Eppendorf離心管內(nèi)，-20℃冰箱凍存，采用硝酸還原酶化學(xué)比色法檢測(cè)血清NO、NOS的含量，高效液相色譜法測(cè)定血清腺苷含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，滿足正態(tài)性時(shí)，采用單因素方差分析。組間比較若方差齊時(shí)采用LSD法檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用Tamhane’s T2法檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組MIRI兔血清中NO、NOS含量的比較 見(jiàn)表1。缺血再灌注組血清NO、NOS的含量較假手術(shù)組相比明顯下降（P＜0.05）；電針組與艾灸組血清NO、NOS的含量較缺血再灌注模型組相比均明顯升高 （P＜0.01），而電針組與艾灸組兩組間無(wú)明顯差異 （P＞0.05）。以上結(jié)果提示，電針、艾灸內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理可以使心肌缺血再灌注損傷兔血清中NO的含量升高，NOS的活性增強(qiáng)。

表1 各組兔血清中NO、NOS、腺苷含量比較（±s）

表1 各組兔血清中NO、NOS、腺苷含量比較（±s）

與假手術(shù)組相比，△P＜0.05；與缺血再灌注組相比，▲P＜0.01。

組 別 n 腺苷（ng/mL）NO（μmol/L） NOS（μmol/L）電針組 8 131.11±18.33▲艾灸組 8 131.76±27.89▲缺血再灌注組 8 82.62±13.85△30.18±3.71▲ 30.2±2，46▲32.86±4.30▲ 30.03±2.06▲24.08±1.14△ 24.62±1.72△假手術(shù)組 8 107.28±5.24 27.58±3.25 27.21±1.73

2.2 針灸內(nèi)關(guān)預(yù)處理對(duì)MIRI兔血清腺苷含量的影響見(jiàn)表1。缺血再灌注組血清腺苷的含量較假手術(shù)組相比明顯下降（P＜0.05）；電針組與艾灸組血清腺苷的含量較缺血再灌注模型組相比均明顯升高（P＜0.01），而電針組與艾灸組兩組間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。以上結(jié)果提示，電針、艾灸內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理可以使心肌缺血再灌注損傷兔血清中腺苷的含量升高。

3 討 論

NO和NOS在心肌缺血再灌注損傷中有重要作用［9］。NO是一種生物活性分子，不僅參與了對(duì)冠脈血管舒縮的調(diào)控，維持有效的冠脈循環(huán)血流，而且對(duì)缺血后心肌的轉(zhuǎn)歸及心肌功能的恢復(fù)可能起著重要的作用。當(dāng)心肌發(fā)生MIRI損傷時(shí)，明確缺血心肌處NO變化規(guī)律及NO對(duì)心肌功能的影響有著重要臨床意義。NOS為一含鐵的單氧化酶，心肌中的NOS是NO的限速酶，其同功酶的活性影響著NO的生物效應(yīng)［10］。Johnson等最早提出NO可減輕心肌缺血再灌注損傷［11］。心肌缺血性損傷時(shí)cNOS mRNA呈低表達(dá)，NOS活性降低，心肌NO的合成和釋放減少，血清NO濃度下降［12-13］。

腺苷是體內(nèi)一種內(nèi)源性嘌呤核苷酸，是ATP降解過(guò)程中的中間產(chǎn)物。在冠狀動(dòng)脈的自動(dòng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。腺苷具有廣泛的心血管效應(yīng)，能夠抑制內(nèi)皮素和去甲腎上腺素釋放，擴(kuò)張冠脈，抑制血小板凝集，保護(hù)微血管結(jié)構(gòu)，減少中性粒細(xì)胞激活，減緩能量消耗，刺激糖酵解，減少超氧陰離子產(chǎn)生。腺苷為一種內(nèi)源性抗炎物質(zhì)，可以降低腫瘤壞死因子-α的合成，而腫瘤壞死因子-α是IR損傷作用的主要炎癥介質(zhì)［15］，從而起到抗炎作用，保護(hù)心肌。

本實(shí)驗(yàn)選用的是內(nèi)關(guān)穴，為手厥陰心包經(jīng)之絡(luò)穴，又為八脈交會(huì)穴，通于陰維脈，手厥陰心包經(jīng)起于胸中，出屬心包絡(luò)，向下通過(guò)橫膈，從胸至腹依次聯(lián)絡(luò)上、中、下三焦，主治心痛、胸悶、心煩等疾患。心包絡(luò)為心“臣使之官”，代心受其損，心主血脈，又主神明，故內(nèi)關(guān)穴可治療心疾血證。《針灸甲乙經(jīng)》云“實(shí)則心暴痛，虛則心煩，心惕惕不能動(dòng)，失智，內(nèi)關(guān)主之”?！峨y經(jīng)》曰“陰維為疾苦心痛”?！夺樉目p源》云“治心暴痛，支滿肘攣，瘧疾氣短”。后人又總結(jié)出“心胸內(nèi)關(guān)謀”，都說(shuō)明了內(nèi)關(guān)穴對(duì)治療心臟疾病具有特異性。

大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)大鼠、兔心肌缺血再灌注具有保護(hù)作用，而這類(lèi)的研究多集中在針刺的即時(shí)保護(hù)效應(yīng)，而針刺的延遲保護(hù)作用則較為偏少。易受鄉(xiāng)等發(fā)現(xiàn)，針刺內(nèi)關(guān)穴對(duì)心肌缺血具有24 h后的延遲保護(hù)作用［8］。 基于缺血預(yù)適應(yīng)（IP）的“第二保護(hù)窗”其時(shí)間長(zhǎng)達(dá) 24～72 h［16］，故本實(shí)驗(yàn)選定觀察針灸后48 h是否具有延遲保護(hù)作用。值得重視的是，目前對(duì)于心肌缺血治療大多集中在針刺，而對(duì)于艾灸的研究不多見(jiàn)，故本實(shí)驗(yàn)設(shè)立的艾灸組，有利于艾灸治病防病的推廣，擴(kuò)大針灸的應(yīng)用范圍。本研究通過(guò)對(duì)兔實(shí)行連續(xù)5 d電針、艾灸內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理，48 h后再造模取材，對(duì)內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)血清NO、NOS和腺苷含量的測(cè)定，來(lái)判斷針灸內(nèi)關(guān)預(yù)處理對(duì)心肌的延遲保護(hù)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)電針、艾灸內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理可以提高兔血清中NO、NOS及腺苷的含量，即可以增強(qiáng)延遲性保護(hù)機(jī)制的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中觸發(fā)物質(zhì)NO、NOS、腺苷的活性和含量，表明了針灸預(yù)處理內(nèi)關(guān)穴可以在48 h這一延遲時(shí)相表達(dá)出針對(duì)缺血再灌注損傷的心肌保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可以為“心胸內(nèi)關(guān)謀”理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有利于針灸“治未病”在臨床的推廣。

［1］曹澤玲，楊樹(shù)庭，龍超良，等.心肌缺血/再灌注損傷的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2006，22（8）：912-916.

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［3］田岳鳳，林亞平，嚴(yán)潔，等.電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)心肌缺血-再灌注損傷預(yù)防保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究（Ⅰ）——對(duì)CK、ET、MDA、NO、NOS 等的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2002，9（1）：12-14.

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The Effect of Acupuncture at Neiguan（PC6） Pretreatment on the Expression of Blood Serum NO，NOS，and Adenosine in Rabbits with MIR

YANG Jingjing，YAN Jie，WANG Chao，et al.Hunan University of Chinese Medicine，Hunan Changsha410208，China

Objective:To observe the effect of acupuncture at Neiguan （PC6） pretreatment on the expression of NO，NOS，and adenosine.Methods:32 New Zealand big-ear rabbits were randomly divided into 4 groups:shamoperation group，ischemia reperfusion group，electric acupuncture preconditioning group and moxibustion pretreatment group.Myocardial ischemia-reperfusion injury model was established by the method of Ligating the anterior descending branch of the left coronary artery for 40 min and then reperfusing for 60 min.After the last bunding for 48 h，rabbits in sham-operation group were chest-opened，threaded and standed for 40 min，then the line was pulled out and standed for 60 minutes，then samples were selected.After the last bunding for 48 mins，rabbits in ischemia reperfusion group were conducted ischemia-reperfusion，then samples were selected；rabbits in electric acupuncture preconditioning and moxibustion pretreatment group were acupunctured at Neiguan （PC6） acupoint respectively.After that for 48 h，ischemia-reperfusion was conducted.Serum adenosine content was determined by high performance liquid chromatography；the content of serum NO and NOS was determined by ELISA method.Results： NO，NOS，and adenosine contents of ischemia-reperfusion group decreased significantly than those of control sham-operation group with statistical difference （P＜0.05）；NO，NOS，and adenosine contents of electric acupuncture preconditioning and moxibustion pretreatment group increased significantly than those of control ischemia-reperfusion group with obviously statistical difference （P＜0.01），but there was no significantly difference between electric acupuncture preconditioning and moxibustion pretreatment group（P＞0.05）.Conclusion： Electric acupuncture pretreatment and moxibustion pretreatment can increase the release of endogenous protection materi-als in serum of MIRI rabbits such as NO，NOS，and adenosine，which indicates the protective effect of acupuncture at Neiguan（PC6） pretreatment on ischemical reperfusion injury in 48 h.

Acupuncture pretreatment；MIR；Neiguan（PC6） acupoint；NO；NOS；Adenosine

R246

A

1004-745X（2014）07-1209-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.07.001

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81072868）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（81102661）；中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院自主開(kāi)放項(xiàng)目（ZZKF06008）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CX2011B338）；浙江省“重中之重”學(xué)科開(kāi)放基金項(xiàng)目（ZTK2010B05）；湖南省教育廳課題（08C633）；湖南省教育廳課題項(xiàng)目（2013sk3086）

△通信作者

2014-02-31）