車杭盈
南平市第二醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,福建南平 354200
肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,目前手術(shù)治療仍是最有效的治療手段,但大多數(shù)患者就診時(shí)已處晚期,失去手術(shù)治療機(jī)會(huì),嚴(yán)重威脅人類健康。白花蛇舌草(Hedyotis diffusa,HD)系茜草科草本植物白花蛇舌草的全草,其味甘、淡,性涼,入心、肝、脾三經(jīng),具消腫、鎮(zhèn)痛及解毒的功效。近來(lái)研究[1]表明,白花蛇舌草具有顯著抗腫瘤活性,對(duì)肝癌、 結(jié)腸癌、白血病、 腦部腫瘤和前列腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞均有明顯的抑制作用,但與肺癌相關(guān)的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究選用非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株作為研究對(duì)象,以不同藥物濃度白花蛇舌草注射液(Hedyotic diffusa willd injection,HDI)作用于A549細(xì)胞,觀察其對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡的影響,并探討其對(duì)肺癌細(xì)胞的潛在抗腫瘤機(jī)制,為將來(lái)臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
HDI購(gòu)自吉林省通化振國(guó)藥業(yè)有限公司。臨用前用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋到終濃度。
CCK-8試劑盒購(gòu)自日本Dojindo公司。Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自?shī)W地利Bender Medsystems公司。Bcl-2、survivin、β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。RPMI-1640培養(yǎng)液、 胎牛血清均源于美國(guó) Gibco BRL公司。熒光倒置顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。電泳槽、半干轉(zhuǎn)膜儀為美國(guó) Bio-Rad公司產(chǎn)品。
非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株購(gòu)自ATCC。置于 37 ℃、5%CO2飽和濕度條件的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)液為含10% FBS的雙抗(100 IU青霉素和100 μg/ml鏈霉素)RPMI-1640培養(yǎng)液。每天更換培養(yǎng)液1次。
細(xì)胞按1×105/ml接種于 96孔培養(yǎng)板。設(shè)3個(gè)HDI組及1個(gè)對(duì)照組,每組細(xì)胞分別加入不同濃度HDI(20、40、80 ml/L)后繼續(xù)培養(yǎng)72 h。每孔加入10 μl WST-8,37 ℃孵育3 h。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD為450 nm處測(cè)量各孔的吸光度值。計(jì)算細(xì)胞存活率,本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
細(xì)胞培養(yǎng)分組同上所述,具體步驟如下:懸浮細(xì)胞離心(2 000 r/min離心5 min)收集,貼壁細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化收集,用PBS洗滌細(xì)胞2次(2 000 rpm離心5 min)收集1~5×105細(xì)胞,加入500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞,加入5 μl Annexin V-FITC混勻后,加入5 μl PI,混勻;室溫、避光、反應(yīng)5~15 min;在30 min內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。Cell Quest軟件分析,本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
收集細(xì)胞,用組織裂解液裂解并勻漿,然后以12 000 r/min離心15 min,取上清,用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度,然后-80 ℃保存。取各組等量蛋白樣品50 μg,以10%的十二烷基磷酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,濕轉(zhuǎn)法使蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,再用5%的脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h,后加入封閉液稀釋的抗Bcl-2抗體、抗survivin抗體、抗β-actin抗體,4 ℃過(guò)夜,洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫輕搖2 h,洗膜后用ECL顯影曝光,應(yīng)用光密度掃描儀掃描各條帶密度。用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析。以靶蛋白與相應(yīng)β-actin的密度積分比值表示靶蛋白表達(dá)水平高低,結(jié)果以實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組密度表示。
不同濃度(20、40、80 ml/L)HDI作用72 h,細(xì)胞增殖明顯被抑制(P<0.05,P<0.01),且隨著藥物濃度逐漸增加,細(xì)胞存活率逐漸下降,表明HDI能明顯抑制細(xì)胞增殖,這種抑制作用具有劑量依賴性。見(jiàn)圖1。
與對(duì)照組比較*P<0.05,**P<0.01圖1 不同濃度HDI對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響
不同濃度(20、40、80 ml/L)HDI作用后,A549細(xì)胞凋亡顯著增加(P<0.05,P<0.01),這種促凋亡作用具有劑量依賴性。見(jiàn)圖2。
與對(duì)照組比較,不同濃度(40、80 ml/L)HDI組A549細(xì)胞Bcl-2和survivin蛋白的表達(dá)顯著下降(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)圖3。
在惡性腫瘤的形成過(guò)程中,細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)扮演重要角色,凋亡相關(guān)基因的突變、缺失或過(guò)度表達(dá),可引起細(xì)胞凋亡障礙或相對(duì)無(wú)限增殖,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展,并對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。因此,如何有效調(diào)控凋亡相關(guān)基因或其產(chǎn)物的表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)腫瘤對(duì)藥物的敏感性是提高腫瘤治療有效率的關(guān)鍵所在。化療在非小細(xì)胞肺癌治療中占據(jù)重要的地位,但多藥耐藥性和藥物不良反應(yīng)較為普遍,影響其療效。中藥不僅能有效抑制腫瘤生長(zhǎng),不容易產(chǎn)生耐藥性,而且對(duì)機(jī)體的損傷和毒副作用相對(duì)輕,因而研究中藥抗腫瘤作用及其分子機(jī)制原理是腫瘤治療領(lǐng)域的重要課題之一。許多研究[2-4]表明,白花蛇舌草在體外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用,腫瘤抑制作用是當(dāng)前白花蛇舌草藥理活性的研究熱點(diǎn),但在非小細(xì)胞肺癌治療的研究方面尚未見(jiàn)報(bào)道。Bcl-2、survivin是目前研究較為深入的凋亡調(diào)控相關(guān)基因,它們是在細(xì)胞凋亡過(guò)程當(dāng)中發(fā)揮重要作用的調(diào)節(jié)蛋白,可抑制細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展。
與對(duì)照組比較*P<0.05,**P<0.01
與對(duì)照組比較*P<0.05,**P<0.01
本研究觀察了HDI對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果表明,HDI可顯著抑制A549 細(xì)胞的增殖并促進(jìn)A549 細(xì)胞凋亡,且隨著藥物濃度的增加,這種作用越明顯。為了進(jìn)一步研究HDI促A549 細(xì)胞凋亡的機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)采用Western blot檢測(cè)HDI作用后A549細(xì)胞中Bcl-2、survivin表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示,HDI顯著抑制A549 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2與survivin的表達(dá),表明HDI對(duì)A549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用與Bcl-2和survivin的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。因此,筆者認(rèn)為Bcl-2和survivin表達(dá)降低是HDI促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡的可能分子機(jī)制之一。
[1] ANJUM R,KHAR A.Differential regulation of apoptosis in AK-5 tumor cells by the protooncogene Bcl-2:presence of Bcl-2 dependent and independent pathways[J].FEBS Lett,2001,499(1-2):166-170.
[2] YU J,ZHANG L.Apoptosis in human cancer cells[J].Curr Opin Oncol,2009,16(1):19-24.
[3] HAEBERLEIN SL.Mitochondrial function in apoptotic neuronal cell death[J].Neurochem Res,2004,29(3):521-530.
[4] WU C,F(xiàn)UJIHARA H,YAO J,et al.Different expression patterns of Bcl-2,Bcl-xl,and Bax proteins after sublethal forebrain ischemia in C57Black /Crj6 mouse striatum[J].Stroke,2003,34(7):1803-1808.