脾腎合劑對順鉑誘導的SD大鼠胃腸損傷的影響*

姚德蛟 陳 玉 蔡 懿 楊 俊 丁芋友 劉 俊 孟春芹

1成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院腫瘤科，成都 610072

2成都中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院，成都 610075

化療被公認為惡性腫瘤的三大治療手段之一。但化療在殺傷腫瘤細胞的同時，也影響了人體的消化系統(tǒng)，最常見的毒性反應(yīng)為惡心嘔吐，其發(fā)生率為60%～90%[1]。消化道反應(yīng)不但影響患者的情緒及進食，還可能造成營養(yǎng)不良、代謝紊亂等并發(fā)癥，甚至導致患者抗拒或放棄化療，影響治療療效。

化療誘發(fā)惡心嘔吐的機制尚不十分清楚，就目前的研究[2]結(jié)果顯示，化療藥物刺激胃腸道黏膜，導致黏膜釋放5-羥色胺(5-HT)，與5-HT受體結(jié)合產(chǎn)生神經(jīng)沖動傳入嘔吐中樞引起嘔吐。5-HT3受體拮抗劑，如昂丹司瓊、格拉司瓊等能明顯減輕化療所致惡心嘔吐，對預(yù)防和治療急性嘔吐療效確切，但對遲發(fā)性嘔吐療效較差[3]。中醫(yī)學認為，毒物(化療藥物)攻伐脾胃，使正氣耗傷，健運失司，氣機阻滯，胃氣上逆而作嘔，而“腎在液為唾”、“腎為胃之關(guān)”，毒物入臟入腑，傷及脾胃，久之及腎，因此化療后患者多有惡心嘔吐、神疲乏力、厭油、納差、腹脹、腹瀉、盜汗、脫發(fā)、腰膝酸軟等脾腎虧虛之癥。故本文以香砂六君子湯合腎氣丸加減組成脾腎合劑，并建立順鉑誘導的SD大鼠胃腸損傷模型，探討脾腎合劑減輕化療引起的胃腸損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通SD大鼠80只，雌雄各半，體重(190±25) g，40 d齡，由成都中醫(yī)藥大學實驗動物研究中心提供(實驗動物許可證號：川實動管使第9號)。

1.2 藥物與試劑

脾腎合劑由人參10 g，茯苓10 g，炒白術(shù)10 g，陳皮10 g，木香10 g，法夏10 g，砂仁10 g，山茱萸10 g，熟地10 g，制附子5 g，肉桂5 g，牛膝10 g，甘草5 g組成。上述藥物均購自成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學生藥教研室鑒定。用約8倍于藥的蒸餾水浸泡藥物30 min，水煎20 min后濾液，再予6倍于藥蒸餾水煎30 min濾液，兩次煎煮而成的濾液混勻，并水浴濃縮成1 g/ml，置于5 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。順鉑注射液，規(guī)格10 mg/2 ml，由江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司提供；鹽酸格拉司瓊注射液，規(guī)格3 mg/3 ml，由南通精華制藥股份有限公司提供。

血清表皮生長因子(EGF)試劑盒由上海森雄科技實業(yè)有限公司提供。5-HT抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供。10%中性福爾馬林溶液由成都中醫(yī)藥大學生物實驗室配制。二抗試劑盒由北京中山生物技術(shù)有限公司提供。高嶺土由蘇州中國高嶺土有限公司提供。1 kg高嶺土粉和10 g阿拉伯樹膠加水攪拌后過篩網(wǎng)，80 ℃烘干，制成小顆粒狀，與大鼠飼料同時放入飼養(yǎng)籠中。

1.3 動物分組和實驗方法

SD大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為4組，即對照組、模型組、格拉司瓊組、脾腎合劑組，每組20只。除對照組外，其余三組大鼠均于第7天按4 mg/kg尾靜脈注射順鉑，對照組、模型組、格拉司瓊組大鼠每日予以生理鹽水20 ml/kg灌胃，格拉司瓊組大鼠按2 mg/kg劑量在注射順鉑0、4、8 h后給予尾靜脈注射格拉司瓊，脾腎合劑組大鼠在格拉司瓊治療基礎(chǔ)上，每日予以脾腎合劑20 ml/kg灌胃，連續(xù)14 d。將大鼠迅速頸椎脫臼處死，腹主動脈采血，立即取出胃、十二指腸組織，胃條取1 cm×1 cm，十二指腸取胃竇與十二指腸交界處2 cm，其中1 cm腸段與胃條一并放入10%福爾馬林液固定48 h，逐級酒精脫水，二甲苯透明、浸臘，石蠟包埋，常規(guī)切片4 nm，蘇木精-伊紅染色。因操作不當，實驗第9天模型組有2只大鼠死亡，格拉司瓊組第10天有1只大鼠死亡，其余各組無死亡。

1.4 觀察和檢測指標

1.4.1 一般情況 毛色、神態(tài)、體重、進食量、“異食癖”表現(xiàn)。每日17：00 pm記錄其進食量，18：00 pm稱各組大鼠體重。

1.4.2 組織學觀察 觀察各組大鼠胃及十二指腸標本絨毛、肌層、漿膜層等形狀、出血情況、炎性滲出等。

1.4.3 酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定大鼠血清EGF水平 腹主動脈采血，離心取血清，按試劑盒說明檢測EGF水平。

1.4.4 免疫組化法檢測大鼠十二指腸嗜鉻細胞(ECL細胞)5-HT的表達 取上述蘇木精-伊紅染色剩余十二指腸段，在10%中性福爾馬林溶液中固定，用免疫組化法測定十二指腸5-HT。染色過程采用SP法，即用生物素標記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶染色及基質(zhì)素混合液來測定細胞和組織中的抗原。IHC染色陽性結(jié)果判定：ECL細胞內(nèi)5-HT表達陽性物質(zhì)呈黃至棕色橢圓形顆粒狀，大多數(shù)均勻分布于細胞質(zhì)內(nèi)，胞核內(nèi)無表達，少部分因ECL細胞具有長突伸入腸腔而在腔內(nèi)可見。用OLYMPUS BX50光學顯微鏡觀察染色結(jié)果。每張切片選一定范圍，輸入圖像分析系統(tǒng)，在200倍鏡下測量ECL細胞5-HT陽性物質(zhì)積分密度。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 脾腎合劑對各組大鼠進食量的影響

第1天，各組大鼠之間的進食量差異無統(tǒng)計學意義。第7天和第14天，與對照組比較，模型組大鼠進食量明顯減少(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，格拉司瓊組大鼠進食量差異無統(tǒng)計學意義，但脾腎合劑組大鼠進食量均明顯增加(P<0.05)。見表1。

2.2 脾腎合劑對各組大鼠體重的影響

第1天和第7天，各組大鼠之間的體重差異無統(tǒng)計學意義。第14天，與對照組比較，模型組大鼠體重明顯減輕(P<0.05)；與模型組比較，格拉司瓊組大鼠體重差異無統(tǒng)計學意義，但脾腎合劑組大鼠體重明顯增加(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠進食量的比較

表2 各組大鼠體重的比較

2.3 各組大鼠異食癖情況比較

對照組大鼠進食高齡土量為(0.28±0.03) g，模型組大鼠進食高齡土量為(0.86±0.05) g，模型組較對照組進食高齡土量明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，格拉司瓊組和脾腎合劑組大鼠進食高齡土量為(0.52±0.02) g和(0.46±0.06) g，明顯減少(P<0.05)。

2.4 胃及十二指腸黏膜蘇木精-伊紅染色結(jié)果

對照組大鼠胃及十二指腸絨毛及肌層平整，絨毛表面沒有滲出物；模型組大鼠胃及十二指腸漿膜層波浪狀，肌層內(nèi)出血，絨毛表面滲出(主要是白細胞)；格拉司瓊組大鼠胃及十二指腸輕度痙攣，絨毛表面無滲出；脾腎合劑組大鼠胃及十二指腸漿膜層輕度波浪形，肌層沒有痙攣，絨毛表面無滲出。見圖1-2。

2.5 ECL細胞5-HT的表達情況

依據(jù)平均光密度檢測結(jié)果，與對照組比較，模型組大鼠ECL細胞5-HT的表達明顯增加，與模型組比較，格拉司瓊組和脾腎合劑組大鼠ECL細胞5-HT的表達明顯降低。見圖3。

A：對照組；B：模型組；C：格拉司瓊組；D：脾腎合劑組

A：對照組；B：模型組；C：格拉司瓊組；D：脾腎合劑組

A：對照組；B：模型組；C：格拉司瓊組；D：脾腎合劑組

2.6 各組大鼠血清EGF水平的比較

對照組大鼠血清EGF水平為(1.40±0.21) pg/ml，模型組大鼠血清EGF水平為(1.35±0.14) pg/ml，模型組血清EGF水平較對照組明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，格拉司瓊組大鼠血清EGF水平為(1.35±0.02) pg/ml，兩組無明顯差異，但脾腎合劑組大鼠血清EGF水平為(1.41±0.02) pg/ml，較其他各組明顯增加(P<0.05)。

3 討論

化療嘔吐歸屬于中醫(yī)“嘔吐”范疇，是使用了化療藥物后出現(xiàn)的外邪致內(nèi)傷的疾病，多數(shù)醫(yī)家認為毒物攻伐脾胃，使正氣耗傷，脾胃健運失司，氣機阻滯，胃氣上逆，臨床表現(xiàn)為惡心、嘔吐，常伴厭油、納差、神疲、腹脹、腹瀉等。脾胃之癥在化療時即可出現(xiàn)，亦有化療后出現(xiàn)嘔吐者。徐氏[4]指出：腎和脾胃關(guān)系為“先天”滋“后天”、“后天”養(yǎng)“先天”。若反復(fù)或長期嘔吐，“后天”不足以養(yǎng)“先天”，必損及腎?！蹲C治匯補》中記載：“若久嘔延及肝腎皆虛，沖氣上逆者，用溫通柔潤之補下焦主治”。腫瘤患者在化療過程中，脾失溫煦，健運失司，聚而為痰、飲、水、濕，阻滯中焦致胃失和降。腎陽不足，命門火衰，臨床上出現(xiàn)盜汗、脫發(fā)、腰膝酸軟等腎虛之癥晚于脾胃虧虛之癥。因此在化療時僅顧護脾胃不夠，應(yīng)同時固腎。因此，本文以香砂六君子湯合腎氣丸加減組成脾腎合劑。方由人參、茯苓、地黃、法夏、炮姜、山茱萸、砂仁、木香、制附片、肉桂等組成。方中人參具有大補元氣，補脾益肺，生津止渴，安神智之功，善治氣虛欲脫，脾氣不足，肺氣虧虛以及血虛陽萎等證?！侗静萁?jīng)疏》言：“人參能回陽氣于垂絕，……益真氣，則五臟皆補矣”。茯苓、法夏、炮姜、山砂仁等健脾和胃，理氣止痛?！睹t(yī)方論》張璐言：“氣虛者，補之以甘?！w人之一身，以胃氣為本，胃氣旺，則五臟受蔭；故凡病久不愈，惟有益胃補腎兩途，……?！狈街械攸S、山茱萸溫補腎元，以補益脾胃?！睹t(yī)方論》柯琴言：“……腎得氣而土自生也。且形不足者溫之以氣，則脾胃因虛寒而致病者固痊，……”。地黃甘微溫，歸肝腎經(jīng)，功效養(yǎng)血滋陰，補精益髓?！侗静菥V目》云：“填骨髓長肌肉，生精血，補五臟內(nèi)傷不足，通血脈，利耳目，黑須發(fā)”。法夏性溫，歸脾胃、肺經(jīng)?！端幮哉摗费裕骸啊_胃健脾，止嘔吐”。山茱萸味酸微溫，歸肝腎經(jīng)，功效補益肝腎，收斂固腎?！秳e錄》云：“強陰益精，安五臟”。現(xiàn)代研究[5]表明，香砂六君子湯能減少胃黏膜瘀血、水腫，減輕炎癥細胞的浸潤，促進胃液的分泌，改善胃腸道內(nèi)分泌功能，調(diào)節(jié)細胞免疫劑體液免疫等。健脾益氣藥物，如人參、白術(shù)、茯苓能提高對化療的耐受力，對多種化療藥物均有明顯的整體解毒作用[6]。半夏生物堿能阻斷5-HT受體、多巴胺受體，抑制腸管的興奮作用[7]。健脾益氣中藥調(diào)節(jié)消化道功能，增加胃腸酶和胃泌素分泌，增加小腸吸收功能，促進RNA和蛋白質(zhì)合成[8]，改善機體營養(yǎng)狀況。腎氣丸源自《金匱要略》，功用補腎助陽，主治腎陽虛損。明末清初名醫(yī)傅山辨治嘔吐時總結(jié)經(jīng)驗特色，病在脾胃，本在腎心[9]?，F(xiàn)代很多醫(yī)家亦從腎論治嘔吐，莫劍鋒等[10]觀察64例采用補脾益腎湯防治胃癌化療的惡心嘔吐反應(yīng)療效確切。

本研究建立順鉑誘導的SD大鼠胃腸損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脾腎合劑組大鼠進食量、體重均高于模型組，病理檢查胃腸黏膜反應(yīng)輕，血清EGF增高，同時ECL細胞內(nèi)5-HT表達較低。EGF增高可抑制胃酸分泌，促進胃腸上皮增生，增加黏膜血流，或促進胃腸黏膜生長，抑制胃腸黏膜的分泌，保護胃腸黏膜。這些是健脾和胃補腎中藥增強機體“正氣”的表現(xiàn)。綜上所述，通過以上研究驗證了脾腎合劑減輕化療后胃腸道的損傷，值得在臨床上運用。

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