響應(yīng)面法優(yōu)化川芎蛋白提取工藝及抗氧化活性研究

謝 丹，魯延杰，李佳璇，阮婧華，唐東昕，辛加敏，查 鑫，范東生

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州貴陽(yáng) 550001）

川芎（Ligusticum chuanxiongHort.）為傘形科植物川芎的干燥根莖，性味辛溫，歸肝、膽、心包經(jīng)，具活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效[1]。首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為著名的川產(chǎn)道地藥材。目前對(duì)川芎所含成分的研究，主要集中于小分子成分，對(duì)川芎大分子成分的研究甚少[2]。前期研究初步表明[3]，川芎中含有豐富的蛋白質(zhì)，且具有較好的抗氧化能力。天然蛋白質(zhì)因其來(lái)源豐富、可生物降解、環(huán)境友好性和高生物活性等特點(diǎn)，近年來(lái)成為天然抗氧化劑的研究熱點(diǎn)。

氧自由基對(duì)生物大分子、氨基酸、DNA、脂類(lèi)和蛋白質(zhì)等造成氧化損傷且與癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、糖尿病、神經(jīng)功能障礙和免疫系統(tǒng)減弱等慢性疾病的發(fā)生有關(guān)[4]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，植物源蛋白質(zhì)具有抗凝血、抗腫瘤、抗氧化和抗真菌等生物活性，如石斛蛋白提取液、葛根蛋白、豌豆蛋白、黑豆蛋白等均具有較好的抗氧化活性[5?8]，對(duì)羥基自由基和DPPH 自由基有良好的清除效果，大豆蛋白具有較強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力[9]。目前，川芎蛋白（LCP）抗氧化能力的相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道，本研究旨在通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面法確定其最佳提取條件；以DPPH 自由基清除、羥自由基清除和超氧陰離子自由基清除率為指標(biāo)，以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行分析，考察LCP 的抗氧化活性，同時(shí)為L(zhǎng)CP 的開(kāi)發(fā)提供可靠的數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

川芎 貴陽(yáng)濟(jì)仁堂藥業(yè)有限公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、考馬斯亮藍(lán)R250、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate,SDS）、Maker、抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品（VC） 北京索萊寶科技有限公司；DPPH 自由基清除能力試劑盒、羥自由基清除能力試劑盒、超氧陰離子清除能力試劑盒 蘇州格銳思生物科技有限公司。

PHS-3C pH 計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；TU-1810 紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；AL204 電子天平 美國(guó)梅特勒托利多公司；FD 冷凍干燥機(jī) 上海拓紛機(jī)械設(shè)備有限公司；Multiskan FC 酶標(biāo)儀 賽默飛（上海）世爾儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白濃度測(cè)定 分別吸取5 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液 4、6、8、10、12、14、16、18、20 μL 于96 孔板中，并用蒸餾水補(bǔ)足至 20 μL。分別加入 200 μL BCA工作液（BCA 試劑與銅試液50:1）混勻，室溫靜置l0 min，于650 nm 下檢測(cè)不同濃度牛血清蛋白溶液的吸光值A(chǔ)，以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=2.2706x+0.0402（R2=0.9993）。川芎提取物中LCP 濃度根據(jù)上述回歸方程求得。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 基于前期研究[10?11]，以LCP 得率為檢測(cè)指標(biāo)，分別以pH、提取時(shí)間、料液比為影響因素以設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.1 川芎藥材前處理 取干燥潔凈的川芎藥材，粉碎，過(guò)3 號(hào)篩（50 目）。稱(chēng)取適量過(guò)篩后的川芎藥材粉末置于圓底燒瓶中，加4 倍量沸程為30～60 ℃石油醚水浴回流脫脂1 h，靜置后過(guò)濾，將川芎藥材粉末于通風(fēng)櫥自然晾干，備用。

1.2.2.2 LCP 的提取 精密稱(chēng)取川芎藥材粉末3 g，平行三份，加入Tris-HCl（68 mmol/L，0.5% SDS，5%甘油，10%β-巰基乙醇）溶液，置于4 ℃ 冰箱浸提1.5 h。5000 r/min 離心10 min，收集上清，加入3 倍量10%TCA-丙酮，置?20 ℃冰箱沉淀1.5 h，5000 r/min 離心10 min，收集沉淀，分別用丙酮及80%丙酮洗滌3 次，5000 r/min 離心10 min，收集沉淀，冷凍干燥即得LCP，按公式（1）計(jì)算得率。

式中：M1表示川芎蛋白凍干粉的質(zhì)量，g；M2表示川芎藥材的質(zhì)量，g。

1.2.2.3 不同pH 對(duì)LCP 得率的影響 按“1.2.2.2”項(xiàng)下操作，固定提取時(shí)間為1.5 h，料液比為1:15 g/mL，研究提取液pH（3、4、5、6、7、8、9）對(duì)LCP 得率的影響。

1.2.2.4 料液比對(duì)LCP 得率的影響 按“1.2.2.2”項(xiàng)下操作，固定提取時(shí)間為1.5 h，提取液pH 為6，研究料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）對(duì)LCP 得率的影響。

1.2.2.5 提取時(shí)間對(duì)LCP 得率的影響 按“1.2.2.2”項(xiàng)下操作，固定料液比為1:20 g/mL，提取液pH 為6，研究提取時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5 h）對(duì)LCP 得率的影響。

1.2.3 LCP 提取條件的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 為選擇最佳實(shí)驗(yàn)條件，以提取時(shí)間 、B 料液比 、C 提取溶劑pH 為獨(dú)立變量，蛋白得率為響應(yīng)變量，采用Design Export 8.0.6 的Box-Behnken 響應(yīng)面方法（RSM）[12]優(yōu)化過(guò)程。各組平行3 次，響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface optimization

1.2.4 SDS-PAGE 凝膠電泳 采用賀小燕等[13]試驗(yàn)方法，以4.5%的濃縮膠和12.5%的分離凝膠進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，濃縮膠電壓80 V 電泳20 min，分離膠電泳120 V 電泳80 min，指示劑到達(dá)分離膠底部約1 cm 處停止電泳，考馬斯亮藍(lán)R250 染色，脫色液脫色至條帶清晰。

1.2.5 LCP 等電點(diǎn)測(cè)定 取10 支潔凈離心管，稱(chēng)重。根據(jù)表2，分別加入不同體積LCP 溶液（50 mg/mL），再分別加入不同濃度、不同體積的乙酸溶液或去離子水，混合，測(cè)定pH。于4 ℃靜置1 h 后，5000 r/min離心15 min。完全除去上清液后，將帶有沉淀物的離心管稱(chēng)重，通過(guò)減重法計(jì)算沉淀質(zhì)量。由于蛋白質(zhì)在pI 處沉淀最多，即可測(cè)定川芎的pI[14?15]。

表2 等電點(diǎn)測(cè)定Table 2 Isoelectric point measurement

1.2.6 LCP 溶解度的測(cè)定 將50 mg 樣品懸浮在10 mL 蒸餾水中，并使用1 mol/mL 的 HCl 或NaOH溶液將懸浮液的pH 調(diào)節(jié)至2～12。將懸浮液在22 ℃下連續(xù)攪拌1 h，并在5000 r/min 離心15 min，BCA 試劑盒測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)的量。溶解度按公式（2）計(jì)算。

式中：M1：懸浮液中加入的蛋白總量，mg，M2：離心后上清液蛋白的量，mg。

1.2.7 LCP 抗氧化能力的測(cè)定

1.2.7.1 羥自由基清除能力的測(cè)定 取不同濃度的LCP 溶液各0.125 mL，按試劑盒加入反應(yīng)試劑一、試劑二、試劑三各0.125 mL 和0.5 mL 的蒸餾水，混勻，即為測(cè)定組。取等體積蒸餾水，依法制備空白組。取不同濃度的LCP 溶液液各0.125 mL，加入反應(yīng)試劑一、試劑二各0.125 mL 和0.625 mL 的蒸餾水，混勻，即為對(duì)照組。于37 ℃反應(yīng)20 min，轉(zhuǎn)移至玻璃比色皿中，蒸餾水調(diào)零，510 nm 讀取各組吸光度值A(chǔ)，平行測(cè)定3 次，以VC為陽(yáng)性對(duì)照組，公式（3）計(jì)算清除率。

式中：A1：空白組吸光度值，A2：測(cè)定組吸光度值，A3：對(duì)照組吸光度值。

1.2.7.2 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定 取不同濃度的LCP 溶液液各0.04 mL，按試劑盒加入反應(yīng)試劑一0.26 mL、試劑二0.32 mL、試劑三0.04 mL、試劑四0.06 mL，混勻，即為測(cè)定組。取等體積蒸餾水，同法制備對(duì)照組。依上述方法，不加試劑三，加蒸餾水補(bǔ)足體積，混勻，即為空白組。于37 ℃反應(yīng)10 min，轉(zhuǎn)移至玻璃比色皿中，蒸餾水調(diào)零，570 nm讀取各組吸光度值A(chǔ)，平行測(cè)定3 次，以VC為陽(yáng)性對(duì)照組，如下公式（4）計(jì)算清除率。

式中：A1：對(duì)照組吸光度值，A2：測(cè)定組吸光度值，A3：空白組吸光度值。

1.2.7.3 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定 分別吸取1.47 mg/mL 的 LCP 溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，加80%甲醇補(bǔ)足至1 mL，備用。取上述不同濃度的LCP 溶液0.4 mL，按試劑盒加入0.6 mL 工作液制，混勻，即得測(cè)定組。取0.4 mL 不同濃度的LCP 溶液與0.6 mL 80% 甲醇溶液為對(duì)照組。取0.4 mL 80% 甲醇溶液與0.6 mL 工作液，充分混勻，即得空白組。室溫避光靜置30 min 使之充分反應(yīng)，無(wú)水乙醇調(diào)零，于517 nm 讀取吸光度值A(chǔ)，每個(gè)濃度的樣品重復(fù)測(cè)定3 次，取均值，以VC為陽(yáng)性對(duì)照組，按公式（5）計(jì)算清除率[16]。

式中：A1：測(cè)定組吸光度值，A2：對(duì)照組吸光度值，A3：空白組吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 DesignExpert 8.0.6 進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)優(yōu)化，用SPSS 26.0軟件進(jìn)行方差分析，以P<0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1（a），LCP 得率先隨pH 的增大而增大。推測(cè)在一定范圍內(nèi)，增大pH，因形成羧基離子和去質(zhì)子胺，蛋白質(zhì)分子中含有更高的負(fù)電荷排斥力，使蛋白質(zhì)和水分子之間的相互作用增加[17?18]，而增加LCP 的溶解度；亦可能是因偏離LCP 的等電點(diǎn)，而增加LCP 的溶解度，最終使LCP 得率增大。pH6 時(shí)LCP 的得率為（2.23%±0.05%），而后LCP 得率隨pH 增大而減小。推測(cè)較高pH 水平下提取樣品時(shí)，因增加淀粉及其他雜質(zhì)物質(zhì)的溶出[15，19]，而稀釋LCP 的濃度。且在堿性條件下，酚類(lèi)化合物易從藥材中釋放并與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合而后快速氧化，導(dǎo)致提取物的顏色呈褐色[20]。經(jīng)方差分析，P=0.002<0.01，表明pH 對(duì)LCP 得率的影響有極顯著性。綜合考慮，選取提取液pH5～7 進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 pH（a）、料液比（b）與時(shí)間（c）對(duì)LCP 得率的影響Fig.1 Influence of pH（a）, liquid（b）and time（c）on the extraction yield of LCP

從圖1（b）可發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)得率因料液比的不同而差異明顯。料液比在1:5～1:15（g/mL）范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)得率逐漸增加，這是由于隨著料液比的增大，溶液中分子擴(kuò)散和碰撞速率加快，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子的溶解。當(dāng)料液比在1:15～1:25（g/mL）范圍內(nèi)，得率逐漸下降，推測(cè)是由于料液比增大而致蛋白質(zhì)分子分散性加大，不易酸沉獲得蛋白質(zhì)，同時(shí)一些可溶性雜質(zhì)溶解阻礙蛋白質(zhì)溶出，且不利于獲得純度較好的蛋白質(zhì)[21]。經(jīng)方差分析，P=0.032<0.05，表明料液比對(duì)LCP 得率的影響具有顯著性。綜合考慮，選取料液比1:10～1:20（g/mL）進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)。

在特定條件下，蛋白質(zhì)浸出需要一定時(shí)間達(dá)到平衡狀態(tài)；時(shí)間較短，分子擴(kuò)散效率一定，蛋白質(zhì)溶出量有限；延長(zhǎng)浸提時(shí)間蛋白質(zhì)得率呈下降趨勢(shì)，可能是由于蛋白質(zhì)長(zhǎng)時(shí)間在堿性環(huán)境中會(huì)發(fā)生輕微水解和變性，而且時(shí)間延長(zhǎng)也會(huì)增加非蛋白物質(zhì)浸出，影響蛋白質(zhì)進(jìn)一步沉淀和蛋白制品的純度[22]，且與同類(lèi)豆類(lèi)如豌豆、大豆和蠶豆相比，川芎富含不同的多糖，多糖與蛋白質(zhì)的相互作用可能導(dǎo)致川芎中提取蛋白的價(jià)值降低[23?24]。經(jīng)方差分析，P=0.023<0.05，表明提取時(shí)間對(duì)LCP 得率的影響具有顯著性。綜合考慮，選取提取時(shí)間1～2 h 進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面分析LCP 提取工藝試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 每組樣品平行測(cè)定3 次，取平均值，并進(jìn)行數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖和統(tǒng)計(jì)分析。Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。結(jié)果如表3 所示，得擬合方程為：y=2.28+0.18A+0.21B+0.19C?0.055AB+0.078AC+0.13BC?0.47A2?0.34B2?0.54C2。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 3 Response surface test scheme and results

2.2.2 方差分析結(jié)果 如表4 所示，模型F=40.23，Pr>F<0.01，說(shuō)明此回歸模型是極顯著的。方程失擬項(xiàng)F=0.89，Pr>F>0.05，失擬項(xiàng)相對(duì)于純誤差影響不顯著，說(shuō)明回歸模型與實(shí)測(cè)值擬合度較好，適用性高，可以使用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)分析試驗(yàn)結(jié)果。各因素的影響大小為：提取時(shí)間<提取溶劑pH<料液比。通過(guò)F檢驗(yàn)來(lái)判定，概率P（F>Fα）的值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高，對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響越大，PA、PB、PC均小于0.01，說(shuō)明提取時(shí)間、料液比、提取溶劑pH 對(duì)LCP 得率的影響極顯著。R2=0.9810，R2Adj=0.9566，表示所建立的模型能夠很好地反映獨(dú)立變量和響應(yīng)變量之間的關(guān)系。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 4 Response surface test variance analysis

2.2.3 因素交互作用 利用Design Expert 8.0.6，根據(jù)回歸方程，生成等高線和響應(yīng)面圖，并考察擬合響應(yīng)曲面的形狀，分析pH、料液比、提取時(shí)間對(duì)LCP得率的影響。在響應(yīng)面圖中，曲線變化越陡峭，說(shuō)明交互影響越顯著。從圖2～圖4 可見(jiàn)，三個(gè)因素在所選范圍內(nèi)存在極值，即等高線中最小橢圓的中心點(diǎn)。結(jié)果表明，BC 交互作用顯著，與F值結(jié)果一致。

圖2 提取時(shí)間與料液比相互作用的等高線圖與響應(yīng)面圖Fig.2 Contour map and response surface map of the interaction between extraction time and liquid-solid ratio

圖3 提取時(shí)間與pH 相互作用的等高線圖與響應(yīng)面圖Fig.3 Contour map and response surface map of the interaction between extraction time and pH

圖4 料液比與pH 相互作用的等高線圖與響應(yīng)面圖Fig.4 Contour map and response surface map of the interaction between liquid-solid ratio and pH

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 經(jīng)軟件分析，該模型得到的最優(yōu)條件為：料液比1:15.65（g/mL）、提取時(shí)間1.58 h、pH6.23。且預(yù)測(cè)LCP 得率理論值為2.35%?？紤]到實(shí)際操作的可能性，將試驗(yàn)條件修正為：料液比為1:15（g/mL）、提取時(shí)間1.5 h、pH6。在該修正條件下進(jìn)行3 次提取試驗(yàn)，平均蛋白質(zhì)得率為（2.36%±0.13%），接近理論值。表明該數(shù)學(xué)模型可用于優(yōu)化LCP 質(zhì)提取過(guò)程。

2.3 SDS-PAGE 凝膠電泳

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5 所示，Tris-HCl 所提LCP 的分子量分布在17～48 kDa 之間，較之月見(jiàn)草蛋白[21]（16～200 kDa）、榴蓮蛋白[25]（20～100 kDa）、向日葵蛋白[26]（300～350 kDa）、扁豆蛋白[19]（50～80 kDa），LCP 分子量較小。有研究提取不同蘑菇中的蛋白質(zhì)并進(jìn)行抗氧化研究，結(jié)果表明分子量較小的蛋白質(zhì)抗氧化能力較強(qiáng)[27]?；钚匝踝杂苫梢哉T導(dǎo)蛋白質(zhì)[28]發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，因其易與蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)衍生化合物相關(guān)的反應(yīng)可能發(fā)生在含有組氨酸的側(cè)鏈上，使蛋白質(zhì)分子具有抗氧化活性。

圖5 LCP SDS-PAGE 凝膠電泳Fig.5 LCP SDS-PAGE gel electrophoresis

2.4 等電點(diǎn)測(cè)定

在等電pH 條件下，蛋白質(zhì)分子上的電荷缺失降低了蛋白質(zhì)分子之間的排斥力，從而促進(jìn)了蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，蛋白質(zhì)沉淀，溶解性降低，最終降低其他功能特性。試驗(yàn)中制備的LCP 提取物在pH 為3.88 時(shí)沉淀最多，如圖6 所示，pH3.88 與其余pH 的蛋白沉淀量之間存在顯著差異（P<0.05），因此pH3.88 可能是LCP 的pI，這可以為分離和純化中選擇離子交換劑或凝膠色譜試劑及后續(xù)研究提供基礎(chǔ)[29]，因等電點(diǎn)附近加熱可以更好地控制蛋白質(zhì)的溶解度，可通過(guò)加熱控制蛋白質(zhì)變性和聚集的程度來(lái)增強(qiáng)蛋白質(zhì)的功能。

圖6 LCP 等電點(diǎn)測(cè)定Fig.6 Measurement of LCP isoelectric point

2.5 溶解度

蛋白質(zhì)溶解度是蛋白質(zhì)變性和結(jié)構(gòu)改變程度的指標(biāo)，也是蛋白質(zhì)功能的良好指標(biāo)。pH 為8（圖7）時(shí)，LCP 的溶解度為96%。LCP 在pH 3～4 之間溶解度最小，當(dāng)pH 偏離pI 時(shí)，蛋白溶解度增大。在pH8 下觀察到較高的溶解度，可能是由于高pH 條件下LCP 部分水解導(dǎo)致末端殘基增多[30]，這些殘基有利于蛋白質(zhì)分子與水的親水性相互作用，如氫鍵和靜電相互作用[19]。

圖7 LCP 溶解度Fig.7 LCP solubility

2.6 LCP 體外抗氧化試驗(yàn)

由圖8（a）可知，在0.3～1.5 mg/mL 范圍內(nèi)，LCP 的羥自由基清除能力隨著濃度的增大而增強(qiáng)，當(dāng)其濃度達(dá)到1.5 mg/mL 時(shí)，羥自由基清除率為60%。陽(yáng)性對(duì)照組 VC的IC50值為0.72 mg/mL，計(jì)算得到LCP 清除羥自由基的IC50值為1.18 mg/mL，由此可知，雖清除效果弱于陽(yáng)性對(duì)照組，LCP 具有一定的羥自由基清除能力。

由圖8（b）可知，LCP 對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力在0.3～1.5 mg/mL 的濃度范圍內(nèi)隨著濃度的增大而增強(qiáng)，呈現(xiàn)較為明顯的量效關(guān)系，當(dāng)其濃度達(dá)到1.5 mg/mL 時(shí)，超氧陰離子自由基清除率達(dá)到78%，清除能力與1.5 mg/mL VC相當(dāng)。通過(guò)計(jì)算可知LCP 清除超氧陰離子自由基的IC50值為 0.57 mg/mL，VC的IC50值0.26 mg/mL。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，LCP具有良好的超氧陰離子清除能力，并呈劑量依賴(lài)性，活性隨蛋白質(zhì)濃度的增加而增加，但不呈線性關(guān)系，推測(cè)是蛋白質(zhì)不完全溶解所致。而超氧自由基能間接誘導(dǎo)脂質(zhì)氧化而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展和生長(zhǎng)[31]。推測(cè)LCP 可作為一種潛在的預(yù)防心血管疾病的天然抗氧化劑進(jìn)一步研究。

由圖8（c）可知，隨著濃度的增加，LCP 的DPPH自由基清除率逐漸增大，二者呈正相關(guān)性，當(dāng)濃度為1.5 mg/mL 時(shí)，DPPH 自由基清除率達(dá)到最大值58.3%。但與陽(yáng)性對(duì)照組VC（IC50值為0.16 mg/mL）相比，LCP（IC50值為 1.31 mg/mL）清除羥自由基的能力較弱，推測(cè)LCP 可能含有較高疏水氨基酸所致[32?33]。

圖8 LCP 對(duì)羥自由基（a）、超氧陰離子自由基（b）、DPPH 自由基（c）的清除率Fig.8 Scavenging rates of（a）hydroxyl radical,（b）superoxide anion radical and（c）DPPH radical by LCP

LCP 顯示出良好的抗氧化活性，可能是由于LCP 中含的氨基酸部分水解，能夠向自由基提供質(zhì)子，從而顯示出抗氧化能力[30]；在適當(dāng)?shù)膒H 條件下提取的LCP，屬小分子量的蛋白質(zhì)，亦可能是增強(qiáng)抗氧化活性的一個(gè)原因[34]。

3 結(jié)論

蛋白來(lái)源豐富，種類(lèi)繁多，在食品及醫(yī)療行業(yè)的應(yīng)用廣泛。天然蛋白質(zhì)是動(dòng)植物體內(nèi)的重要大分子物質(zhì)，具有維持細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)識(shí)別、細(xì)胞粘附、蛋白質(zhì)的加工和轉(zhuǎn)移等生物活性功能和生物活性[35]。本研究首次從中藥川芎中分離蛋白質(zhì)，單因素結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化LCP 提取工藝結(jié)果表明，在pH6、料液比1:15、提取1.5 h 條件下提取LCP，得率為（2.36%±0.13%），Tris-HCl 法可以用于LCP 提取。同時(shí)對(duì)其理化特性進(jìn)行了研究，SDS-PAGE 電泳表明，LCP 的分子量分布在17～48 kDa 之間。LCP 的pI 約為pH3.88；pH 為8 時(shí)，LCP 的溶解度為96%。通過(guò)探索的LCP 的分子量、等電點(diǎn)、溶解度等功能特性，可為其進(jìn)一步研究提供一定的研究基礎(chǔ)，為其在食品工業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

機(jī)體細(xì)胞的癌變，衰老及其它疾病都與機(jī)體內(nèi)自由基的過(guò)量產(chǎn)生有直接的密切聯(lián)系[36]。本研究結(jié)果顯示，LCP 具有良好的抗氧化活性，羥自由基清除能力IC50為1.18 mg/mL、超氧陰離子自由基清除能力IC50為0.57 mg/mL、1，1-二苯基-2-苦基肼基（DPPH）自由基清除能力IC50為1.31 mg/mL。且屬于天然產(chǎn)物，具有比較高的安全性，可作為一種潛在的天然抗氧化劑源。本研究為川芎合理開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供了一些基礎(chǔ)資料，也為開(kāi)發(fā)植物源的天然抗氧劑奠定了良好的基礎(chǔ)。