山東省西瓜細菌性果斑病的病原菌鑒定

張博等

摘要：近年來，在山東省臨沭縣、昌樂縣、章丘縣等地西瓜育苗基地的西瓜苗上發(fā)現(xiàn)了一種新病害——西瓜細菌性果斑病。從病果和病葉片上分離到15個細菌菌株，選取8個菌株進行致病性測定，結(jié)果表明，該8個菌株均能侵染西瓜，發(fā)病癥狀和自然發(fā)病癥狀完全一致；從接種發(fā)病的病果上可重新分離到相同的細菌。對該8個菌株菌體形態(tài)、染色反應(yīng)、培養(yǎng)性狀及其生理生化特性等項目進行觀察測定，確認供試菌株為燕麥食酸菌西瓜亞種（Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems et al.，1992）。

關(guān)鍵詞：西瓜；細菌性果斑??；病原鑒定

中圖分類號：S432.4+2 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2014）03-0083-03

AbstractIn recent years， watermelon had been attacked by a new bacterial disease called bacterial fruit blotch （BFB） in some planting areas of Shandong Province， including Linshu， Changle and Zhangqiu. Fifteen strains were isolated from diseased fruits and leaves of watermelon. The inoculation tests were conducted with 8 strains， which produced the same symptoms as naturally infected plants. And the same strains were isolated from inoculated watermelon. Based on the mycelial morphology， staining reaction， cultural characteristics and a series of physiological and biochemical properties， the pathogens were identified as Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems et al.，1992.

Key wordsWatermelon； Bacterial fruit blotch； Pathogen identification

自2009年始，山東省臨沭縣、昌樂縣、章丘市等西瓜育苗基地西瓜普遍發(fā)生一種細菌性病害，發(fā)病程度輕重不等，如臨沭縣西瓜育苗基地所育26萬株西瓜苗全部封埋銷毀，造成極大損失。2010～2013年筆者在章丘西瓜育苗基地抽檢的西瓜苗上同樣分離到該種細菌，根據(jù)病害癥狀推測是Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems， Goor ， Thieiemans， Gillis， Kersters & Ley。因此，有必要對該細菌性病害的病原菌進行系統(tǒng)鑒定來加以確認，為該病害的防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試材料2009年從山東省臨沭縣大棚采集的雙星、京欣、極品京欣西瓜病果。對照菌株為燕麥食酸菌西瓜亞種（Acidovorax avenae subsp.

citrulli Willems et al.，1992），由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院植物病理學(xué)系提供。

1.1.2培養(yǎng)基NA培養(yǎng)基為分離培養(yǎng)基，KB培養(yǎng)基用于觀察熒光反應(yīng)[3]。

1.2試驗方法

1.2.1病原菌分離、純化取病組織，用滅菌剖解刀切取病健交界處組織，75%酒精消毒2 s，移至0.1%升汞液消毒1～2 min，經(jīng)滅菌水沖洗后置于小瓷皿中研磨，加無菌水浸20 min，然后用移菌環(huán)蘸取組織液在NA培養(yǎng)基劃線，28℃培養(yǎng)48 h，長出單菌落后在NA培養(yǎng)基再劃線，使細菌純化。純化后的各菌株編號保存冰箱中備用。

1.2.2馬鈴薯軟腐將馬鈴薯洗凈用75%酒精表面消毒，切成5 mm厚的薯片，在無菌操作下放在無菌培養(yǎng)皿中。將在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h的供試菌株用移菌環(huán)接在塊莖上，28℃條件下培養(yǎng)48 h后，觀察馬鈴薯軟腐情況。

1.2.3病原菌的致病測定8個菌株與對照菌株在28℃條件下培養(yǎng)24 h，配成3×108個/ml菌懸液，噴霧和刺傷接種于健康西瓜幼苗4～6葉和果實，同時以接清水為對照（CK）。在28℃下保濕48 h，之后白天光照，晚上保濕，每天注意觀察發(fā)病情況。

1.2.4細菌學(xué)性狀細菌的格蘭氏染色、形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀、生理生化測定等，主要參照《植病研究方法》[3]、《一般細菌常用鑒定方法》[7]、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[2]等方法進行。

2結(jié)果與分析

2.1病害癥狀

西瓜果斑病田間可危害西瓜幼苗子葉、定植后的西瓜葉片（子葉及真葉）和果實（幼果和成熟果）。定植前幼苗發(fā)病，葉尖或葉緣出現(xiàn)水漬狀小斑點，逐漸向子葉基部擴展為條形或不規(guī)則形暗綠色水漬狀斑點，沿中脈變黑。真葉受害開始為水漬狀小斑點，逐漸擴大成為多角形（因受葉脈限制）或不規(guī)則形褪綠病斑，隨病情的發(fā)展，病斑逐步變?yōu)楹稚?，干枯下陷。西瓜果實發(fā)病后，初期在西瓜表面出現(xiàn)水漬狀小斑點，隨病情發(fā)展，病斑逐漸擴展為圓形或不規(guī)則形的大型暗綠色斑塊，病斑處有大量乳白色菌液溢出，后期病斑變成褐色，并多處開裂，將西瓜剖開，西瓜果肉腐爛，出現(xiàn)“水瓤瓜”現(xiàn)象，最后引起整個果實腐爛。

2.2病原菌分離

通過分離純化共獲得8個菌株用于致病性測定和病原菌的鑒定。

2.3致病性測定

8個菌株致病性測定都表現(xiàn)出與田間病害癥狀相同的典型癥狀。接種發(fā)病后的病斑經(jīng)再分離，其菌落性狀和初分離時一致。

2.4細菌學(xué)性狀鑒定

2.4.1細菌的形態(tài)及染色反應(yīng)供試8個菌株格蘭氏染色均呈陽性反應(yīng)，菌體呈桿狀，兩端鈍圓，大小為（2～3）mm×（0.50～0.51）mm，不產(chǎn)生芽孢和莢膜，單根極生鞭毛（圖1）。

2.4.2病原菌培養(yǎng)性狀供試菌株在KB培養(yǎng)基上28～30℃下培養(yǎng)48 h，菌落呈乳白色，較小、圓形、隆起、有光澤、表面光滑、不透明、無黃色、不產(chǎn)熒光。最適生長溫度為24～30℃，41℃能生長。

2.4.3病原菌生理生化性狀測定從表1可知，8個供試菌株與對照菌株測試結(jié)果一致，都不能在KB培養(yǎng)基產(chǎn)生熒光，不產(chǎn)生果聚糖，（氧化）精氨酸雙水解酶陰性，不能產(chǎn)生吲哚，不能水解淀粉，甲基紅試驗陰性，能使馬鈴薯軟腐，氧化酶和過氧化氫酶陽性，硝酸還原產(chǎn)生H2S，V.P試驗陽性，明膠液化，41℃生長等。

2.4.4病原菌碳源利用從表2可知，8個供試菌株與對照菌株測試結(jié)果大都一致，8個供試菌株可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖、果糖、海藻糖、棉籽糖、甘露糖、山梨醇、甜醇、肌醇等，不能利用纖維二糖、木糖、鼠李糖、β-丙氨酸、L-亮氨酸等。

3結(jié)論與討論

西瓜果斑病最早于1969年在美國佛羅里達州被發(fā)現(xiàn)[8]。我國報道西瓜果斑病在1998年[5]。Schaad等[9]在美國佐治亞州發(fā)現(xiàn)西瓜苗凋萎病，病原菌被首次鑒定為類產(chǎn)堿假單胞菌西瓜亞種（Psendomonas psendoalcaligenes subsp. citrulli）。 Willems[10]等根據(jù)西瓜果斑病病原菌的rRNA-DNA和DNA-DNA分子雜交研究結(jié)果，將其更改為Acidovorax avenae subsp. citrulli（Schaad et al.）。

我國吉林、福建[1，4]、海南、河北、山西等地都有類似病害發(fā)生，但多數(shù)研究大都引用國外的鑒定結(jié)果。本研究通過對山東省西瓜病果分離菌株的致病性測定，發(fā)現(xiàn)其發(fā)病病斑與自然發(fā)病癥狀完全一致，且從接種發(fā)病植株重新分離到完全相同的細菌。該供試菌株格蘭氏染色、菌體形態(tài)、培養(yǎng)性狀、生理生化測定等細菌學(xué)性狀與張榮意[5]和趙廷昌[6]的基本相同。但個別性狀如麥芽糖、棉籽糖、甘露糖、肌醇等測定結(jié)果與張榮意等的報道不同，對麥芽糖、肌醇、甜菜堿等的測定結(jié)果與趙廷昌等報道的不同。這可能由不同地區(qū)間菌系的差異或碳素化合物的純度不同造成的。

綜上所述，供試8個菌株的致病性、形態(tài)及染色反應(yīng)、菌落培養(yǎng)性狀、生理生化性狀及碳源利用結(jié)果均一致，為同一種病原菌——類產(chǎn)堿假單胞菌西瓜亞種（Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli Schaad et al.，1978）[9，10]，即燕麥食酸菌西瓜亞種（Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems et al.，1992）。

我國于2006年將西瓜細菌性果斑病列入全國農(nóng)業(yè)植物性有害生物。近年來，我們只對山東省個別縣市西瓜細菌性果斑病進行分離鑒定。為了防止該病的危害和擴展蔓延，減少給果農(nóng)造成的損失，我們正展開對全省各縣市的全面調(diào)查并積極開展藥劑防治試驗。

參考文獻：

[1]蔡學(xué)清， 黃月英， 楊建珍，等. 福建省西瓜細菌性果斑病的病原鑒定[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報， 2005， 34（4）： 434-437.

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[6]趙廷昌， 孫福在， 王兵萬， 等. 哈密瓜細菌性果斑病病原菌鑒定[J]. 植物病理學(xué)報， 2001， 31（4）： 357-364.

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[9]Schaad N W， Sowell Jr. G， Goth R W， et al. Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli. subsp. nov.[J]. lnt. J. Syst. Bacteriol.， 1978， 28： 117-125.

[10]Willems A， Goor M， Thielemans S， et al. Transfer of several phyeopathogenic Pseudomonas species to Acidovorax as Acidovorax avenae subsp. avenae subsp. nov.， comb. nov.， Acidovorax avenae subsp. citrulli，Acidovorax avenae subsp. cattleyae， and Acidovorax konjaci[J]. Int. J. Syst. Bacteriol，1992，42 （1）：107-119.

2.3致病性測定

8個菌株致病性測定都表現(xiàn)出與田間病害癥狀相同的典型癥狀。接種發(fā)病后的病斑經(jīng)再分離，其菌落性狀和初分離時一致。

2.4細菌學(xué)性狀鑒定

2.4.1細菌的形態(tài)及染色反應(yīng)供試8個菌株格蘭氏染色均呈陽性反應(yīng)，菌體呈桿狀，兩端鈍圓，大小為（2～3）mm×（0.50～0.51）mm，不產(chǎn)生芽孢和莢膜，單根極生鞭毛（圖1）。

2.4.2病原菌培養(yǎng)性狀供試菌株在KB培養(yǎng)基上28～30℃下培養(yǎng)48 h，菌落呈乳白色，較小、圓形、隆起、有光澤、表面光滑、不透明、無黃色、不產(chǎn)熒光。最適生長溫度為24～30℃，41℃能生長。

2.4.3病原菌生理生化性狀測定從表1可知，8個供試菌株與對照菌株測試結(jié)果一致，都不能在KB培養(yǎng)基產(chǎn)生熒光，不產(chǎn)生果聚糖，（氧化）精氨酸雙水解酶陰性，不能產(chǎn)生吲哚，不能水解淀粉，甲基紅試驗陰性，能使馬鈴薯軟腐，氧化酶和過氧化氫酶陽性，硝酸還原產(chǎn)生H2S，V.P試驗陽性，明膠液化，41℃生長等。

2.4.4病原菌碳源利用從表2可知，8個供試菌株與對照菌株測試結(jié)果大都一致，8個供試菌株可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖、果糖、海藻糖、棉籽糖、甘露糖、山梨醇、甜醇、肌醇等，不能利用纖維二糖、木糖、鼠李糖、β-丙氨酸、L-亮氨酸等。

3結(jié)論與討論

西瓜果斑病最早于1969年在美國佛羅里達州被發(fā)現(xiàn)[8]。我國報道西瓜果斑病在1998年[5]。Schaad等[9]在美國佐治亞州發(fā)現(xiàn)西瓜苗凋萎病，病原菌被首次鑒定為類產(chǎn)堿假單胞菌西瓜亞種（Psendomonas psendoalcaligenes subsp. citrulli）。 Willems[10]等根據(jù)西瓜果斑病病原菌的rRNA-DNA和DNA-DNA分子雜交研究結(jié)果，將其更改為Acidovorax avenae subsp. citrulli（Schaad et al.）。

我國吉林、福建[1，4]、海南、河北、山西等地都有類似病害發(fā)生，但多數(shù)研究大都引用國外的鑒定結(jié)果。本研究通過對山東省西瓜病果分離菌株的致病性測定，發(fā)現(xiàn)其發(fā)病病斑與自然發(fā)病癥狀完全一致，且從接種發(fā)病植株重新分離到完全相同的細菌。該供試菌株格蘭氏染色、菌體形態(tài)、培養(yǎng)性狀、生理生化測定等細菌學(xué)性狀與張榮意[5]和趙廷昌[6]的基本相同。但個別性狀如麥芽糖、棉籽糖、甘露糖、肌醇等測定結(jié)果與張榮意等的報道不同，對麥芽糖、肌醇、甜菜堿等的測定結(jié)果與趙廷昌等報道的不同。這可能由不同地區(qū)間菌系的差異或碳素化合物的純度不同造成的。

綜上所述，供試8個菌株的致病性、形態(tài)及染色反應(yīng)、菌落培養(yǎng)性狀、生理生化性狀及碳源利用結(jié)果均一致，為同一種病原菌——類產(chǎn)堿假單胞菌西瓜亞種（Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli Schaad et al.，1978）[9，10]，即燕麥食酸菌西瓜亞種（Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems et al.，1992）。

我國于2006年將西瓜細菌性果斑病列入全國農(nóng)業(yè)植物性有害生物。近年來，我們只對山東省個別縣市西瓜細菌性果斑病進行分離鑒定。為了防止該病的危害和擴展蔓延，減少給果農(nóng)造成的損失，我們正展開對全省各縣市的全面調(diào)查并積極開展藥劑防治試驗。

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[10]Willems A， Goor M， Thielemans S， et al. Transfer of several phyeopathogenic Pseudomonas species to Acidovorax as Acidovorax avenae subsp. avenae subsp. nov.， comb. nov.， Acidovorax avenae subsp. citrulli，Acidovorax avenae subsp. cattleyae， and Acidovorax konjaci[J]. Int. J. Syst. Bacteriol，1992，42 （1）：107-119.

2.3致病性測定

8個菌株致病性測定都表現(xiàn)出與田間病害癥狀相同的典型癥狀。接種發(fā)病后的病斑經(jīng)再分離，其菌落性狀和初分離時一致。

2.4細菌學(xué)性狀鑒定

2.4.1細菌的形態(tài)及染色反應(yīng)供試8個菌株格蘭氏染色均呈陽性反應(yīng)，菌體呈桿狀，兩端鈍圓，大小為（2～3）mm×（0.50～0.51）mm，不產(chǎn)生芽孢和莢膜，單根極生鞭毛（圖1）。

2.4.2病原菌培養(yǎng)性狀供試菌株在KB培養(yǎng)基上28～30℃下培養(yǎng)48 h，菌落呈乳白色，較小、圓形、隆起、有光澤、表面光滑、不透明、無黃色、不產(chǎn)熒光。最適生長溫度為24～30℃，41℃能生長。

2.4.3病原菌生理生化性狀測定從表1可知，8個供試菌株與對照菌株測試結(jié)果一致，都不能在KB培養(yǎng)基產(chǎn)生熒光，不產(chǎn)生果聚糖，（氧化）精氨酸雙水解酶陰性，不能產(chǎn)生吲哚，不能水解淀粉，甲基紅試驗陰性，能使馬鈴薯軟腐，氧化酶和過氧化氫酶陽性，硝酸還原產(chǎn)生H2S，V.P試驗陽性，明膠液化，41℃生長等。

2.4.4病原菌碳源利用從表2可知，8個供試菌株與對照菌株測試結(jié)果大都一致，8個供試菌株可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖、果糖、海藻糖、棉籽糖、甘露糖、山梨醇、甜醇、肌醇等，不能利用纖維二糖、木糖、鼠李糖、β-丙氨酸、L-亮氨酸等。

3結(jié)論與討論

西瓜果斑病最早于1969年在美國佛羅里達州被發(fā)現(xiàn)[8]。我國報道西瓜果斑病在1998年[5]。Schaad等[9]在美國佐治亞州發(fā)現(xiàn)西瓜苗凋萎病，病原菌被首次鑒定為類產(chǎn)堿假單胞菌西瓜亞種（Psendomonas psendoalcaligenes subsp. citrulli）。 Willems[10]等根據(jù)西瓜果斑病病原菌的rRNA-DNA和DNA-DNA分子雜交研究結(jié)果，將其更改為Acidovorax avenae subsp. citrulli（Schaad et al.）。

我國吉林、福建[1，4]、海南、河北、山西等地都有類似病害發(fā)生，但多數(shù)研究大都引用國外的鑒定結(jié)果。本研究通過對山東省西瓜病果分離菌株的致病性測定，發(fā)現(xiàn)其發(fā)病病斑與自然發(fā)病癥狀完全一致，且從接種發(fā)病植株重新分離到完全相同的細菌。該供試菌株格蘭氏染色、菌體形態(tài)、培養(yǎng)性狀、生理生化測定等細菌學(xué)性狀與張榮意[5]和趙廷昌[6]的基本相同。但個別性狀如麥芽糖、棉籽糖、甘露糖、肌醇等測定結(jié)果與張榮意等的報道不同，對麥芽糖、肌醇、甜菜堿等的測定結(jié)果與趙廷昌等報道的不同。這可能由不同地區(qū)間菌系的差異或碳素化合物的純度不同造成的。

綜上所述，供試8個菌株的致病性、形態(tài)及染色反應(yīng)、菌落培養(yǎng)性狀、生理生化性狀及碳源利用結(jié)果均一致，為同一種病原菌——類產(chǎn)堿假單胞菌西瓜亞種（Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli Schaad et al.，1978）[9，10]，即燕麥食酸菌西瓜亞種（Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems et al.，1992）。

我國于2006年將西瓜細菌性果斑病列入全國農(nóng)業(yè)植物性有害生物。近年來，我們只對山東省個別縣市西瓜細菌性果斑病進行分離鑒定。為了防止該病的危害和擴展蔓延，減少給果農(nóng)造成的損失，我們正展開對全省各縣市的全面調(diào)查并積極開展藥劑防治試驗。

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