黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈藥劑敏感性研究

陳琦

摘 要：本研究對在黑龍江省科學(xué)合理地使用甲霜靈這類苯基酰胺類殺菌劑防治馬鈴薯晚疫病，對當(dāng)?shù)赝硪卟〉姆乐嗡巹┹啌Q，防治策略的制定等具有重要的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；晚疫病菌；甲霜靈；敏感性

馬鈴薯晚疫病是當(dāng)前黑龍江省危害馬鈴薯生產(chǎn)較為嚴(yán)重的病害之一，一般造成減產(chǎn)20 %～50 %，嚴(yán)重達(dá)50 %以上，甚至絕產(chǎn)。進(jìn)入2000年以來，黑龍江省晚疫病呈現(xiàn)出逐年加重的趨勢，而且發(fā)生地時間大幅度提前，經(jīng)濟(jì)損失更加嚴(yán)重。晚疫病的發(fā)生和流行，已經(jīng)嚴(yán)重地阻礙了黑龍江省馬鈴薯生產(chǎn)發(fā)展和實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程。目前生產(chǎn)上對晚疫病的防治主要有培育抗病品種和藥劑防治兩種方法。以甲霜靈為代表的苯基酰胺類殺菌劑是防治晚疫病的有效藥劑之一，1977年在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用，該類藥劑對馬鈴薯晚疫病有很好防效，具有保護(hù)兼治療的作用，但在推廣3年之后就出現(xiàn)了抗藥菌株，Davidse等和Dowley等首先報道在荷蘭和愛爾蘭分別出現(xiàn)了抗甲霜靈的菌株，隨后在歐洲、中東、亞洲、墨西哥、加拿大和美國等地相繼出現(xiàn)抗性菌株，當(dāng)前世界各國凡是使用以甲霜靈為代表的苯基酰胺類殺菌劑的地區(qū)，都不同程度地出現(xiàn)了晚疫病菌的抗藥性問題。在國內(nèi)李煒等最先報道了1994年采自河北、黑龍江、內(nèi)蒙、甘肅等地的馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈的抗性情況，隨后朱杰華、楊志輝等、袁善奎等、金光輝先后進(jìn)行了我國及黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌甲霜靈類藥劑敏感性的研究，所有研究結(jié)果均表明在我國黑龍江省不僅普遍存在對甲霜靈具有抗藥性的晚疫病菌株，而且抗藥菌株的出現(xiàn)頻率很高。

晚疫病菌對甲霜靈藥劑的敏感性是研究晚疫病菌表型結(jié)構(gòu)的重要內(nèi)容。在前人研究的基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈藥劑敏感性的監(jiān)測研究，這對在黑龍江省科學(xué)、合理、有效的使用甲霜靈藥劑防治馬鈴薯晚疫病，以及化學(xué)藥劑防治策略的制定，具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1晚疫病菌標(biāo)本的分離和純化

1.1.1病樣的采集 2012年7～9月份晚疫病發(fā)生和流行的時候，在黑龍江省加格達(dá)奇市、海倫市、哈爾濱市和牡丹江市未施用過甲霜靈的馬鈴薯田塊中采集晚疫病病葉，采集病樣時用消毒小刀在健康的馬鈴薯塊莖上切一小口，然后在田間將病葉的單個病斑剪下并夾入薯塊中，最后用吸水紙和線繩包扎好后放入保鮮袋中帶回實驗室。采集的寄主品種有東農(nóng)303、早大白、魯引1號、大西洋、克新13號、龍引薯1號、春薯4號共7個寄主品種。

1.1.2病菌的分離純化保存 將病葉用自來水沖洗干凈，取其病健交界處的部分，剪成小塊兒，放在薯片上，每一薯片上放一小塊病葉。把接有病葉的薯片放在培養(yǎng)皿中保濕培養(yǎng)。在18℃培養(yǎng)箱中黑暗保濕培養(yǎng)。3～5 d后，待薯片上長出白色的菌絲，即可把薯片上的菌絲轉(zhuǎn)入純化培養(yǎng)基上。把純化好的晚疫病菌從純化培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)入試管中，放入18 ℃黑麥培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)至菌絲鋪滿試管培養(yǎng)基斜面后，轉(zhuǎn)入14 ℃低溫黑暗保存，備用。

黑麥培養(yǎng)基制作方法：黑麥60 g浸泡在800 mL蒸餾水中36 h，之后用粉碎機(jī)粉碎，過濾獲得的濾液中加蒸餾水定容至1000 mL，再加入瓊脂16 g，蔗糖15 g，121 ℃滅菌30 min，在無菌條件下倒入平板或試管中備用。

1.2晚疫病菌對甲霜靈藥劑的敏感性測定

1.2.1供試藥劑 98 %甲霜靈原藥由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所袁善奎博士提供。以甲醇為溶劑，將原藥配制成濃度為5000 μg·mL-1母液，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2晚疫病菌對甲霜靈的敏感性測定 參照Shattock的方法，用打孔器在培養(yǎng)好的病菌菌落中隨機(jī)取直徑為5 mm的菌餅，分別接種到含甲霜靈10 μg·mL-1及無藥的黑麥培養(yǎng)基平板上，每個處理重復(fù)3次，18 ℃下黑暗培養(yǎng)，7 d后測定菌落直徑（mm），并計算各菌株的相對生長量。

各菌株對甲霜靈的敏感性劃分標(biāo)準(zhǔn)為：PG≤10 %為敏感菌株；10 %

2 結(jié)果與分析

2.1黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈藥劑的敏感性

表1 黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈藥劑的敏感性測定結(jié)果

從黑龍江省4個地區(qū)（牡丹江，加格達(dá)奇，哈爾濱，海倫）共分離獲得44株晚疫病菌，其中來自牡丹江和海倫市有12個菌株，哈爾濱9個菌株，加格達(dá)奇11個菌株，這44個菌株中敏感菌株有20個，出現(xiàn)的頻率為45.45 %；中抗菌株有2個，出現(xiàn)頻率為4.54 %，高抗菌株為22個，出現(xiàn)的頻率為50 %（表2）。從總體來看，黑龍江省的馬鈴薯晚疫病菌中對甲霜靈藥劑具有抗藥性菌株的出現(xiàn)頻率高于敏感菌株。而且該地區(qū)的馬鈴薯晚疫病菌的群體結(jié)構(gòu)中，高抗菌株不僅占優(yōu)勢，而且抗性程度很高。

表2 黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈藥劑的敏感性情況

2.2黑龍江省不同地區(qū)晚疫病菌對甲霜靈藥劑的敏感性

無論是馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)還是非主產(chǎn)區(qū)，都存在著對甲霜靈產(chǎn)生抗藥性的菌株。但是不同地區(qū)對甲霜靈產(chǎn)生的抗藥性的菌株出現(xiàn)的頻率不同。各地區(qū)的菌株數(shù)及其對甲霜靈藥劑的敏感性的測定情況見表3，從表中可以看出，各地區(qū)之間抗藥菌株的頻率存在著較大的差異，除了加格達(dá)奇地區(qū)之外，其他三個地區(qū)都存在著抗甲霜靈藥劑的晚疫病菌，其中牡丹江抗藥菌株為12株，哈爾濱地區(qū)抗藥菌株為9株，兩地區(qū)的抗藥菌株達(dá)到了100 %，而海倫地區(qū)抗藥菌株為3株，海倫的抗藥菌株占被測菌株的16.6 %，加格達(dá)奇沒有出現(xiàn)抗藥菌株，11株菌株全為敏感菌株。

表3 黑龍江省不同地區(qū)晚疫病菌對甲霜靈藥劑敏感性的測定

3 討論

3.1黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈藥劑敏感性年度間的動態(tài)變化。黑龍江省自1988年開始在生產(chǎn)中大面積使用甲霜靈藥劑來防治馬鈴薯晚疫病，在國內(nèi)相對于其它省區(qū)，對黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌敏感性的研究報道較早，李煒等[4]利用薯盤測定法對采自1994年黑龍江省克山縣的8個馬鈴薯晚疫病菌株進(jìn)行了甲霜靈藥劑的敏感性測定，抗藥菌株的頻率為87.5 %。朱杰華采自2001～2002年黑龍江省的哈爾濱、克山、望奎和大興安嶺31個菌株進(jìn)行了甲霜靈藥劑的敏感性研究，結(jié)果31個菌株均為高抗，抗性頻率為100 %。楊志輝等利用菌落直徑法對1998～2003年采自黑龍江省23個馬鈴薯晚疫病菌菌株對甲霜靈的抗性測定，結(jié)果被檢測的所有菌株均為高抗菌株，其抗性頻率為100 %。袁善奎等對采自黑龍江省2003年的29個菌株和2004年的69個菌株進(jìn)行了甲霜靈敏感性檢測，結(jié)果表明，抗性菌株的頻率分別達(dá)到86.2 %和82.6 %。金光輝對2004～2006年來自黑龍江省10個縣市的70個馬鈴薯晚疫病菌進(jìn)行了甲霜靈藥劑敏感性測定，結(jié)果具有抗藥性的菌株有52個，占菌株總數(shù)的74.29 %。其中2004年測試的菌株中抗藥菌株的頻率為81.82 %；2005年抗藥菌株的頻率為70.00 %；2006年抗藥菌株的頻率為73.46 %。本實驗的抗藥菌株出現(xiàn)頻率為50 %。從近些年來年度間抗藥菌株的頻率變化情況來看，在黑龍江省對甲霜靈藥劑具有抗藥性菌株的出現(xiàn)頻率整體上呈現(xiàn)下降的趨勢。

3.2黑龍江省不同地區(qū)晚疫病菌對甲霜靈藥劑敏感性的差異。本研究表明，黑龍江省對甲霜靈藥劑具有抗藥性的菌株出現(xiàn)頻率自北向南呈逐步增加的趨勢，加格達(dá)奇的菌株均為敏感型，海倫市的抗藥菌株下降到了25 %以下，這與以前的研究結(jié)果明顯不同，可能是當(dāng)?shù)馗挠闷渌N類的殺菌劑有關(guān)，有待于進(jìn)一步的深入研究。根據(jù)本試驗結(jié)果可知，在加格達(dá)奇和海倫市可以繼續(xù)使用甲霜靈類藥劑進(jìn)行晚疫病的防治。另外，在牡丹江和哈爾濱市的晚疫病菌均為高抗菌株，今后在這兩個地區(qū)不能使用甲霜靈類藥劑防治晚疫病，需要改用其它類型殺菌劑。

4 結(jié)論

4.12012年來自黑龍江省的四個地區(qū)的44個晚疫病菌株中，敏感菌株有20個，出現(xiàn)的頻率為45.45 %；中抗菌株有2個，出現(xiàn)頻率為4.54 %，高抗菌株為22個，出現(xiàn)的頻率為50 %，黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌中對甲霜靈藥劑具有抗藥性的菌株占很大比重。

4.2區(qū)域間抗藥菌株的出現(xiàn)頻率具有很大差異，其中牡丹江、哈爾濱地區(qū)抗藥菌株達(dá)到了100 %，海倫的抗藥菌株為16.6 %，加格達(dá)奇沒有出現(xiàn)抗藥菌株。