石蠟制片的方法、技巧與注意事項(xiàng)

何艷艷

摘 要：石蠟切片法是常規(guī)制片技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的1種。在整個(gè)制片過(guò)程中，環(huán)節(jié)多而且相互影響、相互制約，每1個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)總的制片質(zhì)量都有極大的影響，所以，每1步必須嚴(yán)格操作。在此以朱槿的子房為例，將制片過(guò)程主要分為前、中、后3個(gè)工作時(shí)期，詳細(xì)的介紹石蠟切片的方法、技巧與注意事項(xiàng)。同時(shí)在脫水與透明的過(guò)程用抽氣泵抽氣，此與常規(guī)方法不同，而且本文介紹的方法比較簡(jiǎn)單，主要為環(huán)境條件較差的石蠟制片提供實(shí)驗(yàn)參考。

關(guān)鍵詞：石蠟切片 方法 技巧 注意事項(xiàng)

石蠟切片法是以石蠟作為包埋劑，用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)將材料切成薄片，經(jīng)熬蠟、取材、固定、抽氣、洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊、切片、粘片、脫蠟、染色、封片等一系列處理制成永久制片的方法。在研究植物的細(xì)胞、組織、胚胎以及形態(tài)等方面石蠟切片法是最理想的制片方法。細(xì)胞和組織多為無(wú)色透明，離開(kāi)機(jī)體后會(huì)很快發(fā)生溶解和腐敗，細(xì)胞原始形態(tài)和結(jié)構(gòu)難以保存[1 ]。通過(guò)石蠟切片制作技術(shù)，可以長(zhǎng)期的保持其形態(tài)結(jié)構(gòu)，進(jìn)行觀察研究。但缺點(diǎn)是石蠟切片制作過(guò)程復(fù)雜，制作周期長(zhǎng)，組織塊易破碎，切片皺褶多等[2 ]。所以，在每1步操作中都要嚴(yán)格、小心謹(jǐn)慎。通過(guò)長(zhǎng)期的摸索，在實(shí)驗(yàn)條件稍差的情況下，總結(jié)出相應(yīng)的方法技巧和注意事項(xiàng)，以此保證制片的成功性。

1 前期工作

1.1 材料準(zhǔn)備

朱槿子房采自廣西大學(xué)。實(shí)驗(yàn)儀器：電磁爐、抽氣裝置、恒溫水浴鍋、恒溫箱、石蠟切片機(jī)、顯微鏡。實(shí)驗(yàn)試劑：無(wú)水乙醇、95 %乙醇、甲醛、冰醋酸、TO透明劑、石蠟熔點(diǎn)56 ℃～58 ℃（根據(jù)自己材料的硬度選擇合適的熔點(diǎn)），中性樹(shù)膠。

取材方法：

大面積的在朱槿開(kāi)花的第1 d進(jìn)行標(biāo)記，每1 d采摘5個(gè)，直到采摘到不能采摘，如采摘第1 d到第16 d的朱槿子房，當(dāng)有花瓣時(shí)，要去除所有的花瓣，撥到只剩子房。

注意事項(xiàng)：

①一般在晴天的早晨9：00～10：00時(shí)取材，此時(shí)植物細(xì)胞分裂活動(dòng)較明顯。

②取材后馬上固定，以保證植物細(xì)胞自然狀態(tài)，而不至于在細(xì)胞死亡之前材料的形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

1.2 固定材料

FAA固定液固定，甲醛：冰醋酸：70 %乙醇=5：5：90[3 ]，幼嫩材料用50 %乙醇，代替70 %乙醇，可防止材料收縮，還可以加入5 mL甘油（丙三醇）以防止蒸發(fā)和材料變硬。材料固定完畢，貼上標(biāo)簽。

注意事項(xiàng)：

①FAA固定液稱為萬(wàn)能固定液，一般固定的時(shí)間不低于24 h。

②材料較大時(shí)，最好要切成3～5 mm長(zhǎng)，還要切掉不需要的材料，這樣既有利于固定又有利于其他溶液與石蠟的進(jìn)入。

③固定液用量要達(dá)到材料體積的20～50倍，否則，材料中的水分稀釋固定液的濃度，降低固定效果[3 ]。

④固定時(shí)要對(duì)材料進(jìn)行真空抽氣，組織、細(xì)胞中都有空氣，會(huì)組織固定液滲透到組織中，使固定不全面不徹底，影響后續(xù)的浸蠟、切片等[3 ]。抽氣最好用抽氣泵抽氣20～30 min，用小藥瓶裝時(shí)，簡(jiǎn)易的可用注射器抽氣。

1.3 熬制石蠟

用70 ℃左右溫度的電磁爐熬制石蠟，只要一冒煙就關(guān)閉，在恒溫箱中過(guò)濾，然后將石蠟用燒杯裝置放在70 ℃的水浴鍋中熬制，7 d左右，也可能更多天，具體要看石蠟的質(zhì)量，其實(shí)熬制石蠟的時(shí)間在多不在少，越熬制越好用。若是有必要過(guò)濾就再過(guò)濾1次。

注意事項(xiàng)：

①在此過(guò)程中要切記每天去看看水浴鍋是否要加水，不能讓水干掉，以免出現(xiàn)事故。

②不能讓水進(jìn)入石蠟中，若有少量水進(jìn)入可用加熱的滴管吸出，若有大量水進(jìn)入只要將上層石蠟倒入到另1個(gè)燒杯即可。

③使用之前可以用切片機(jī)試試石蠟是否能切出完好無(wú)缺的石蠟片，若不能就必須繼續(xù)熬制。

④石蠟在使用過(guò)程中，可以重復(fù)使用，如浸蠟時(shí)的石蠟可收集與下次再使用，包埋用過(guò)的石蠟可過(guò)濾后再次使用。

2 中期工作

2.1 脫水

先用與固定液同濃度的酒精清洗，再用70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %乙醇溶液，到無(wú)水酒精2次（2次無(wú)水酒精脫水是為了更徹底），每1級(jí)用抽氣裝置抽氣20 min，靜止20 min。此過(guò)程的作用是讓1種既溶于水又溶于TO的酒精把固定液徹底替換出來(lái)，并使材料中的水分逐步（逐級(jí)）被吸出來(lái)。TO不溶于水，所以材料中的水必須完全被酒精取代，TO才能完全滲透到細(xì)胞中。

注意事項(xiàng)：

①在整個(gè)過(guò)程中，使用指形管比較方便，同時(shí)節(jié)約溶液。

②在更換高1級(jí)的脫水劑時(shí)，最好不要移動(dòng)材料，以免損壞材料。

③高濃度酒精對(duì)組織有強(qiáng)烈收縮及脆化缺點(diǎn)，因此用酒精脫水不能直接入純酒精中脫水，而必須經(jīng)過(guò)由高到低一系列不同濃度的酒精，逐漸取代組織中水分，以保證脫水徹底，并避免組織過(guò)度收縮和硬化。

2.2 透明

2/3無(wú)水乙醇+1/3TO、1/2無(wú)水乙醇+1/2TO、1/3無(wú)水乙醇+2/3 TO，TO 2次（2次TO透明是為了更徹底），每1級(jí)抽氣20 min，靜置20 min。由于TO溶劑能使材料透明，因此這個(gè)過(guò)程稱為“透明”。為了避免材料收縮，采取逐步從酒精中過(guò)渡到TO中。

2.3 浸蠟

將材料用少量TO與石蠟放在電熱恒溫水浴鍋中56 ℃過(guò)夜（我用的是熔點(diǎn)56 ℃～58 ℃石蠟），6～7 d，可打開(kāi)蓋，讓TO慢慢蒸發(fā)，然后，將電熱恒溫水浴鍋升至58 ℃用包埋所用的純蠟，每1 d換1次，共處理2～3次。最好是借助弄幾個(gè)與指形管差不多大小洞的泡沫板，放在電熱恒溫水浴鍋上，然后把指形管插進(jìn)燒杯上面的泡沫板，這樣是為了避免有水進(jìn)去。此過(guò)程目的要從低溫到高溫，從低濃度到高濃度，使石蠟慢慢滲人到組織中，將石蠟完全代替材料中的透明劑，這樣切片時(shí)材料才不會(huì)切壞。切記要回收廢蠟，并標(biāo)明清楚，以利于下次使用。endprint

注意事項(xiàng)：

①第1步到第3步必須連續(xù)完成。

②在這3步中，溶液最好稍多于指形管1/3的容積，否則會(huì)脫水、透明、浸蠟不徹底，造成實(shí)驗(yàn)失敗，太多則可能因抽氣而溢出。

③在浸蠟的過(guò)程中，千萬(wàn)不能有水進(jìn)入到指形管中，否則將不能切片成功。

2.4 包埋

先將材料從指形管倒入用電磁爐水浴的小燒餅中，把溶解的石蠟轉(zhuǎn)入包埋盒內(nèi)，馬上用熱鑷子夾取材料放入盒內(nèi)彼此間留一定距離并整齊排放，待到盒內(nèi)蠟面漸呈薄膜凝固，面平放與水中浸沒(méi)后翻轉(zhuǎn)盒底向上，將己冷卻凝固的蠟塊撈出盒底向上晾干，也可以使它自然冷卻。

注意事項(xiàng)：根據(jù)材料大小，確定所需紙盒的尺寸，用表面光滑的牛皮紙預(yù)先疊好。

2.5 切片

用粘有TO的藥棉擦洗切片的刀，固定好，調(diào)到你要切片的厚度（我主要切10 μm厚），然后把蠟塊切成小塊粘在小木塊上，用粘有石蠟的玻璃棒在酒精燈上加熱，粘在小蠟塊與小木塊的邊界處，使小蠟塊與小木塊固定好，便可以切片。

2.6 貼片

用玻璃棒粘少量的雞蛋清輕輕點(diǎn)一點(diǎn)在載玻片上，然后用手涂抹均勻，再加較多的蒸餾水，選一些較好的切片整齊地貼在載玻片上，此時(shí)是切片漂浮在水面上。

雞蛋清制取：在雞蛋上開(kāi)1個(gè)小孔，讓蛋清流入瓶中，蛋黃完全在蛋殼內(nèi)，最好是放置在冰箱中保存。

注意事項(xiàng)：在切片與貼片過(guò)程中，使用毛筆更加方便。

2.7 展片

將貼好片的載玻片快速地放在酒精燈加熱，蠟片受熱后會(huì)慢慢伸平，然后用吸水紙吸走多余的水分，讓石蠟片緊緊的貼在載玻片上。

注意事項(xiàng)：把貼好片的載玻片地放在酒精燈加熱時(shí)，要控制好時(shí)間，最好是快速地加熱一會(huì)，然后移開(kāi)觀察，氣溫的差異直接影響時(shí)間的多少。

2.8 染色

石蠟切片經(jīng)TO（5～10 min直到TO完全溶化）、第2次TO（時(shí)間自定）、1/2+1/2（10～30 s）、100 %（10～30 s）、95 %（10～30 s）、85 %（10～30 s）、70 %（10～30 s）、50 %（10～30 s）各級(jí)酒精溶液、蒸餾水（10～30 s）、1 %番紅溶液中染色約（1～2 h），蒸餾水（2 min）、50 %（10～30 s）、70 %（10～30 s）、85 %（10～30 s）、95 %（10～30 s）各級(jí)酒精溶液、0. 2 %固綠（2 min）、95 %（10～30 s）酒精、100 %（10～30 s）酒精、1/2無(wú)水酒精+1/2TO（10～30 s）、TO（10～30 s）。由于染色劑中有大量的水，所以脫蠟后的無(wú)水材料必須從高濃度的酒精開(kāi)始，逐級(jí)進(jìn)入低濃度的酒精溶液，最后一級(jí)通常的50 %酒精，使材料中的水分逐漸增加，這個(gè)過(guò)程稱為復(fù)水。如果不經(jīng)過(guò)復(fù)水，材料脫蠟后直接進(jìn)入染色劑中，材料將會(huì)嚴(yán)重變形，甚至難以染色。

注意事項(xiàng)：

①上面的時(shí)間大多是根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)有所更改。

②染色的方法有許多，番紅——固綠法是比較常用的一種。

③使用染色的玻璃杯，更方便。

3 后期工作

封片

在載玻片上放上中性樹(shù)膠，從側(cè)面慢慢移動(dòng)蓋上蓋玻片，在恒溫箱中32 ℃烘干或置于室內(nèi)自然晾干[4 ]。

注意事項(xiàng)：

①玻片中不能有氣泡存在，若有，可將載玻片置于酒精燈上來(lái)回?cái)[動(dòng)，以除去氣泡。

②玻片不能在日光下曬干，以免退色。

4 實(shí)驗(yàn)分析

制作的朱槿子房的石蠟切片在光學(xué)顯微鏡下觀察，結(jié)構(gòu)清晰。此石蠟切片的方法，在脫水與透明的過(guò)程明顯與一般的石蠟切片的方法有所不同，主要采取抽氣泵抽氣的方法來(lái)縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，否則1 d之內(nèi)很難連續(xù)做完脫水與透明，同時(shí)因?yàn)榇舜胧┰黾恿藢?shí)驗(yàn)的成功率。此外在許多細(xì)節(jié)上提出了注意事項(xiàng)與操作技巧，在石蠟切片中，制作程序繁多，每1步操作對(duì)最后制片效果都有極大影響，所以細(xì)節(jié)是決定成敗的重要因素，因此實(shí)驗(yàn)時(shí)要嚴(yán)格、認(rèn)真、細(xì)致操作，才能得出完好的切片和清晰的觀察。

參考文獻(xiàn)

[1] Wang Jinping，Zhang Junmei. Manufaction of paraffin section on Chinese pulsatilla flower[J]. Journal of Xinyang Normal University：Natural Science Edition，2008，21（4）： 573-576.

[2] 付霞，劉金華，梁秀就. 大鼠眼球標(biāo)本石蠟切片的改良制作方法[J]. 眼科新進(jìn)展，2007，27（6）：417-419.

[3] 段國(guó)祿，施江，等. 植物制片、標(biāo)本制作和植物鑒定[M]. 北京：氣象出版社，2008.

[4] 張寶華. 聚焦植物石蠟切片制作[J]. 吉林省教育學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，29（4）：153-154.endprint