凝集素親和層析技術(shù)分離金花茶多糖的研究

路垚+林華娟+楊基住

摘 要：以蓖麻凝集素（RCA）為親和配體制備親和層析樹脂，在比較2種固定載體制備親和樹脂對金花茶多糖分離效果的基礎(chǔ)上，探討了多糖上樣量、NaCl濃度以及洗滌量對RCA-Sepharose-2B親和樹脂結(jié)合率或再生效果的影響，并采用高效液相色譜（HPLC）對親和多糖進行分離效果分析，為將親和層析技術(shù)應(yīng)用于金花茶活性多糖的分離純化提供科學依據(jù)。研究結(jié)果顯示，相比AF-Amino-650 m樹脂，RCA-Sepharose 2B親和樹脂的分離效果比較好，而且可以進行反復(fù)使用多次。多糖上樣量顯著影響多糖與樹脂的親和效果，多糖結(jié)合率隨上樣量增加呈倒U型變化，當多糖上樣量為10.4 mg/g親和層析樹脂時，其親合率最高，達到57 %左右；NaCl濃度對樹脂的再生效果也有顯著影響，用含0.2 mol/L NaCl的磷酸緩沖液洗滌樹脂可以有效恢復(fù)樹脂對多糖的親和效果。HPLC分析結(jié)果顯示分離獲得的親和活性多糖是由3種不同分子量的多糖組分組成。

關(guān)鍵詞：金花茶 多糖 蓖麻凝集素 親和層析 分子量

金花茶（Camellia chrysantha（Hu）Tuyama）為山茶科、山茶屬、金花茶組植物，常綠灌木或小喬木；僅分布于我國廣西及越南北部。因其特有的金黃花色和生理活性功能，被稱為“茶族皇后”、“植物界的大熊貓”?，F(xiàn)代研究表明，金花茶具有抗氧化[1-5 ]、抑制腫瘤生長[6-8 ]、降血脂[9-10 ]等生理活性，其中多糖被認為是重要的生理活性成分之一，但其構(gòu)效關(guān)系尚不清楚。動物試驗研究結(jié)果顯示，金花茶粗多糖具有明顯的降血脂作用[10 ]。田曉春等[11 ]采用離子交換柱層析對金花茶多糖進行分離純化得到TPS0、TPS1、TPS2、TPS3、TPS4、TPS5 6個組分，隨后林華娟等[12 ]進一步采用凝膠柱層析對TPS3組分進行分離純化，又將其分為2個多糖組分，并對其進行了化學結(jié)構(gòu)特征分析。這些研究結(jié)果表明，金花茶多糖組成相當復(fù)雜。由于所用的離子交換柱層析和凝膠柱層析等傳統(tǒng)分離純化方法效率低、損失大，通過這些方法僅能獲得少量純化多糖用于化學結(jié)構(gòu)分析，不能滿足其功能研究需求。因此有必要探索采用其他分離技術(shù)進行金花茶多糖的分離純化。在前期研究中，路垚等[13 ]探討了金花茶多糖與伴刀豆凝集素、蓖麻凝集素、歐衛(wèi)矛凝集素等的凝集反應(yīng)特性，結(jié)果表明金花茶多糖與凝集素有明顯的凝集反應(yīng)特征，推測能與凝集素發(fā)生凝集反應(yīng)的多糖很可能就是活性多糖，但是與不同凝集素其凝集反應(yīng)強度有明顯的差異，其中與蓖麻凝集素的凝集反應(yīng)為最強。因此本研究嘗試以蓖麻凝集素為親和配體，制備親和層析樹脂，探討將親和層析技術(shù)應(yīng)用于金花茶活性多糖的分離純化，為金花茶活性多糖的高效分離純化提供理論依據(jù)。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗原料

金花茶葉片于2012年3月采摘于廣西防城港市十萬大山金花茶基地，采摘后立即微波烘干，送至廣西桂人堂金花茶股份有限公司實驗室，粉碎分裝，于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

親和層析基質(zhì)AF-Amino-650 m，TOSOH公司（日本）；親和層析基質(zhì)Sepharose-2B，上海萊寶生物科技有限公司；蓖麻凝集素（RCA），Vector公司（美國）。

1.2 實驗儀器

LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津公司；Sugar KS-804分析色譜柱，昭和通商株式會社。

2 實驗方法

2.1 一般化學測定方法

蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍法進行[14 ]。

總糖含量的測定采用苯酚硫酸法進行[15 ]。

2.2 金花茶多糖的制備

金花茶多糖的制備。稱取 10 g金花茶葉粉末，加入10倍量蒸餾水，在 121 ℃條件下提取30 min，冷卻后先用紗布過濾，過濾液再通過離心（1.8 ×104 r/min，15 min）去除殘渣，得到提取上清液。殘渣用同樣方法反復(fù)提取 2 次，將得到的提取上清液混合均勻。提取液再經(jīng)過乙醇沉淀得到沉淀多糖。沉淀多糖用少量水溶解后經(jīng)過充分透析（截留分子量 12 ku），冷凍干燥后得到金花茶多糖。

2.3 RCA-Amino凝集素親和層析樹脂的制備

取5 mL AF-Amino-650 m，用0.1 mol/L的 NaHCO3 緩沖液（pH 9.0）反復(fù)抽濾清洗，轉(zhuǎn)入10 mL 40 %的乙二胺溶液（pH 10.0）中，4 ℃下溫和攪拌6 h，置于4 ℃冰箱下過夜，砂芯漏斗過濾，加入10 mL 含0.2 m乙二醇的0.1 mol/L NaHCO3緩沖液（pH 9.0），室溫下溫和攪拌2 h，抽濾，用0.1 mol/L的NaHCO3 緩沖液（pH9.0）充分洗滌，去除乙二醇，加入10 mL含1 %戊二醛的0.1 mol/L NaHCO3緩沖液（pH9.0），室溫下溫和攪拌10 min，抽濾，用0.1 mol/L的 NaHCO3 緩沖液（pH 9.0）充分洗滌，去除戊二醛，加入2 mL含5 mg/mL蓖麻凝集素（RCA）和75 mg/mL半乳糖的0.1 mol/L NaHCO3 緩沖液（pH 9.0），室溫下溫和攪拌30 min，抽濾，加入10 mL 含0.2 mol/L甘氨酸的0.1 mol/L NaHCO3 緩沖液（pH 9.0），室溫下溫和攪拌1 h，抽濾，用超純水，2 mol/L 的 NaCl溶液，超純水，0.1 mol/L 醋酸鈉緩沖液（pH 4.5），超純水依次洗滌，最后用50 mmol/L的磷酸緩沖液（pH 7.4）充分洗滌，即得到RCA-Amino親和層析樹脂，加入防腐劑，冰箱內(nèi)保存待用[16 ]。根據(jù)偶聯(lián)前后凝集素（以蛋白質(zhì)含量計）的變化計算偶聯(lián)率。

2.4 RCA-Sepharose 2B凝集素親和層析樹脂的制備

Sepharose-2B的活化[16 ]：取5 mL的 Sepharose- 2B，放入砂芯漏斗中，用蒸餾水反復(fù)清洗3～5次，將Sepharose-2B懸液與2 mol/L Na2CO3溶液按體積比1：1 的比例混成懸浮液，緩慢攪拌，再加速攪拌，在通風櫥中加5 mL濃度約為1 g/mL溴化氰的乙腈溶液，用6 mol/L的NaOH 溶液調(diào)pH至10.5 左右，穩(wěn)定后計時15 min，迅速轉(zhuǎn)移至砂芯漏斗內(nèi)抽濾，用200 mL冰冷的濃度為0.1 mol/L NaHCO3 緩沖液（pH 9.0）進行沖洗，抽干成濕餅狀，轉(zhuǎn)移至pH 為10的40 %的乙二胺溶液中，冰浴下攪拌5 h，放入4 ℃冰箱過夜。