蘭花組培快繁研究進(jìn)展

李慧敏

摘 要：文章綜述了蘭花組織培養(yǎng)快繁技術(shù)的研究進(jìn)展，著重闡述了不同外植體、培養(yǎng)因素對(duì)類原球莖誘導(dǎo)、增殖和分化的影響，扼要介紹了蘭花快繁存在的問題，并對(duì)未來(lái)蘭花的研究與開發(fā)進(jìn)行了初步的探討。

關(guān)鍵詞：蘭花 組培 快繁

蘭花是整個(gè)蘭科植物（orchidaceac）的總稱，主要分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)。我國(guó)以西南、東南地區(qū)居多。蘭花花型奇特，花色高潔、花香素雅，有“花中君子”之稱，可盆栽，也可作為切花，深受各國(guó)人民喜愛，具有很高的觀賞價(jià)值和商業(yè)價(jià)值。自然條件下，蘭科植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，無(wú)性繁殖困難。傳統(tǒng)的分株繁殖方式繁殖系數(shù)低，而有性繁殖也存在胚發(fā)育不完全，無(wú)子葉和胚乳，萌發(fā)時(shí)間長(zhǎng)，萌發(fā)率極低等不足，難以大量繁殖和生產(chǎn)。隨著人們對(duì)蘭花需求量日益增大，傳統(tǒng)繁殖已無(wú)法滿足市場(chǎng)需求。通過組織培養(yǎng)建立無(wú)性繁殖體系進(jìn)行繁殖，具有繁殖系數(shù)高，速度快、不受季節(jié)限制、可周年生產(chǎn)，短期內(nèi)可獲得大量實(shí)生苗等優(yōu)點(diǎn)。本文旨在總結(jié)蘭花組培快繁培養(yǎng)的研究進(jìn)展。

1 外植體的選擇

蘭花組織培養(yǎng)根據(jù)所選外植體的不同可分為莖尖和側(cè)芽培養(yǎng)、葉片培養(yǎng)、根尖培養(yǎng)、花器官培養(yǎng)等。

1.1 莖尖和側(cè)芽

莖尖和側(cè)芽頂端部分分生區(qū)的細(xì)胞具有分裂能力強(qiáng)，易誘導(dǎo)，遺傳穩(wěn)定等特性。對(duì)于遠(yuǎn)緣雜交所獲得的品系，用此法可得到與母體遺傳性狀一致的植株。莖尖較適于復(fù)莖性蘭花的快速繁殖，已經(jīng)被有效用于大花蕙蘭（Cymbidium）、卡特蘭（Cattleya）、石斛蘭（Dendrobium）、文心蘭（Oncidium）、金線蓮（Anoectochilus）、鶴頂蘭（Phaius）、香子蘭（Vanilla）、竹葉蘭（Arundina）等蘭花花芽和類原球莖（Protocorm like body，PLB）的誘導(dǎo)。這可能是由于莖尖及其周圍組織較為幼嫩，容易脫分化并再分化成完整植株。但對(duì)一些單莖性蘭花，如蝴蝶蘭（Phalaeanopsis）、指甲蘭（Aerides）等，摘取其莖尖就有可能損失母株，造成浪費(fèi) [1，2]，因此人們?cè)趯?shí)際應(yīng)用中傾向于尋找其他可能的外植體。

1.2 葉片

與莖尖不同，葉片作為外植體，不需要母株做出犧牲，數(shù)量多，取材也不受季節(jié)如花期的限制。Wimber就率先從蕙蘭的葉子中誘導(dǎo)得到PLB [1]。幼葉比老葉的誘導(dǎo)反應(yīng)強(qiáng)，更容易誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚，葉基部又比遠(yuǎn)軸端的葉尖強(qiáng)。萬(wàn)代蘭（Vanda）幼嫩葉片整個(gè)表面都能誘導(dǎo)得到分生組織，而相對(duì)老的外植體，則局限于葉片基部；80 %的葉片基部都能夠增殖?；鹧嫣m（Renanthera imschootiana）在葉尖部位沒有誘導(dǎo)反應(yīng)時(shí)，葉基部仍能誘導(dǎo)出嫩芽，獲得再生植株。而藍(lán)色萬(wàn)代蘭（V.coerulea）成熟植株的葉片并不能誘導(dǎo)得到嫩芽或者PLB [3，4]。這表明在同樣的培養(yǎng)條件下，可以根據(jù)不同的誘導(dǎo)反應(yīng)來(lái)判斷外植體的來(lái)源和生理學(xué)年齡。切割方式和外植體大小均對(duì)PLB的誘導(dǎo)也有影響。橫切比縱切效果好，6分片段的誘導(dǎo)率最高 [5]。

1.3 花梗和花梗芽

利用花?；蚧üＱ窟M(jìn)行快繁也是不必犧牲母株的一種方法。自Rotor利用蝴蝶蘭離體花梗誘導(dǎo)得到蝴蝶蘭組培苗后，這項(xiàng)技術(shù)被迅速?gòu)V泛用于獲得大量的蝴蝶蘭種苗。目前蝴蝶蘭的快繁方法中，許多都是利用花序基部的休眠芽進(jìn)行快繁培養(yǎng)獲得的。在誘導(dǎo)蝴蝶蘭的PLB過程中，花梗芽的發(fā)育階段、芽齡是影響誘導(dǎo)率的主要因素。成熟花梗誘導(dǎo)獲得的再生芽較少；而幼嫩花梗能夠更有效的誘導(dǎo)得到再生植株 [6]。除蝴蝶蘭外，花梗培養(yǎng)已在萬(wàn)代蘭，樹蘭，石斛蘭，文心蘭，苞舌蘭等屬中獲得成功 [1]。

1.4 地下莖段

利用根狀莖進(jìn)行離體誘導(dǎo)得到小植株，具有簡(jiǎn)易可行的優(yōu)點(diǎn)。根狀莖可以通過種子誘導(dǎo)直接得到，也可以由假鱗莖上的側(cè)芽誘導(dǎo)得到。對(duì)于許多陸生蘭而言，尤其是對(duì)具有重要商業(yè)價(jià)值的蘭花而言，這是一個(gè)非常有效的途徑。通過根狀莖誘導(dǎo)可以得到春蘭、蕙蘭、寒蘭等的再生苗。對(duì)大部分寒蘭的根狀莖而言，BAP是最好的細(xì)胞分裂素；BAP的加入，能夠減少分支，將分生組織轉(zhuǎn)換為PLB，誘導(dǎo)根狀莖頂部向上形成嫩芽，并長(zhǎng)成植株 [7]。Chang等選取寒蘭根狀莖頂端1cm部位，置于含0.01～1 mg/lTDZ的培養(yǎng)基上，能夠從根狀莖莖尖誘導(dǎo)得到2～3個(gè)植株嫩芽 [8]。但Shimasaki等的研究表明，在常規(guī)的寒蘭幼苗生產(chǎn)中，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用并非必要 [9]。這可能是加入生長(zhǎng)素后，會(huì)導(dǎo)致根狀莖分生組織的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域減少，葉片形成受阻滯和引起分生組織派生物快速分離。

1.5 根段

對(duì)于多個(gè)蘭花品種，通過根段進(jìn)行植株再生的研究已有報(bào)道。利用氣生根能夠進(jìn)行蘭花繁殖，但形成植株的能力很低。美洲石斛的根系離體后在培養(yǎng)基中能長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持成活，卻無(wú)法形成芽或者PLB。有研究表明，蝴蝶蘭能夠通過根尖誘導(dǎo)得到愈傷組織，獲得再生植株。飄唇蘭根系在含NAA的培養(yǎng)基中能夠誘導(dǎo)得到愈傷組織，加入椰奶、蛋白胨、維生素B后誘導(dǎo)率能達(dá)到54 %。由于飄唇蘭根系自身的代謝特性，根系能夠誘導(dǎo)得到大量的PLB；與幼嫩的根系相比，成熟的根系分生組織能夠更簡(jiǎn)易快速的獲得營(yíng)養(yǎng)芽 [10]。與大部分其他蘭花品種如文心蘭、卡特蘭相比，飄唇蘭的這個(gè)過程具有增加有絲分裂活性的特性，對(duì)于涉及生化、生理學(xué)、植物細(xì)胞分化方面很有參考價(jià)值。

2 組培快繁影響因素

2.1 培養(yǎng)基

用于蘭花組培的培養(yǎng)基種類繁多，目前最常用的培養(yǎng)基為MS、VW、KC、RM、White和它們的改良型，應(yīng)用時(shí)可根據(jù)不同蘭花品種和培養(yǎng)階段采用不同配方的培養(yǎng)基。春蘭和蕙蘭根狀莖在MS培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率最高，出現(xiàn)褐化情況也較少 [11，12]。搖動(dòng)可能有助于消除培養(yǎng)基的極性，提高曝氣，增加表面積，加速有毒代謝物的稀釋，刺激PLB的形成。生物反應(yīng)器的應(yīng)用也加速了蘭花的快繁。將20 g蝴蝶蘭的葉片片段，置于生物反應(yīng)器中（內(nèi)含混合了木炭過濾物質(zhì)的2l花寶培養(yǎng)基）浸入式培養(yǎng)8周，能夠獲得18000個(gè)左右的PLB [13]。金線蓮的莖尖在含3l花寶培養(yǎng)基（包含著曝氣裝置，通氣量0.006 vvm）的球形生物反應(yīng)器中培養(yǎng)一段時(shí)間后，轉(zhuǎn)移到0.75l花寶培養(yǎng)基（含2 g/L蛋白胨、0.5 g/L活性炭）中培養(yǎng)，能得到伸長(zhǎng)并已生根的小植株 [14]。

2.2 植物激素

用于蘭花組培的外源激素主要是生長(zhǎng)素類和細(xì)胞分裂素類，根據(jù)不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段配予所需激素的量和種類。生長(zhǎng)素能夠刺激根狀莖的分支、鮮重；細(xì)胞分裂素能夠有效刺激根狀莖片段誘導(dǎo)植株再生。TDZ、2iP、玉米素等能促進(jìn)蝴蝶蘭葉片的體細(xì)胞胚胎發(fā)生，IAA、IBA，NAA，2，4-D卻鈍化體細(xì)胞的形成 [14]。用加入TDZ（0.3～3 mg/L）的1/2 MS培養(yǎng)基培養(yǎng)蘭花，20 d后就能得到從嫩葉中誘導(dǎo)出的體細(xì)胞胚。經(jīng)過TDZ處理，從5～7 cm長(zhǎng)的葉片中獲取的單個(gè)外植體，能夠生成17～24個(gè)胚胎，而從2～4 cm長(zhǎng)的葉片獲取的外植體中能產(chǎn)生5～13個(gè)PLB [15，16]。Chang將TDZ用于植株再生，選取寒蘭根狀莖頂端1 cm部位，置于無(wú)TDZ和低TDZ的培養(yǎng)基中，只能獲得根狀莖，并不形成小植株；而在加入0.01～1 mg/L TDZ的培養(yǎng)基上，能夠從根狀莖莖尖誘導(dǎo)得到2～3個(gè)植株嫩芽 [8]。為了研究生長(zhǎng)素誘導(dǎo)葉尖部位體細(xì)胞胚胎發(fā)生的效果，Chen等試驗(yàn)了IAA、2，4-D、TIBA、槲皮素和PCIB的效果，結(jié)果顯示，除了TIBA，其他的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑都抑制體細(xì)胞胚的形成。嘧啶醇和多效唑能促進(jìn)金蝶蘭屬植株葉片誘導(dǎo)體細(xì)胞胚形成，能提高誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎形成過程，GA3和矮壯素則有抑制作用。乙烯在較低濃度時(shí)明顯抑制，在高濃度卻能促進(jìn)；乙烯還能夠降低AgNO3和CoCl2產(chǎn)生的抑制作用 [17，18]。適宜濃度的AgNO3和CoCl2能提高原球莖的增殖系數(shù) [19]。BAP對(duì)誘導(dǎo)蘭花植株形成、將根狀莖組織轉(zhuǎn)換為PLB、直接形成多倍體植株都很有效 [9]。培養(yǎng)基中加入NAA和BAP使蕙蘭和春蘭根狀莖芽誘導(dǎo)率更高，春蘭根狀莖的增殖倍數(shù)達(dá)到5.25 [11，12]。

2.3 天然提取物

天然提取物如蛋白胨、胡蘿卜汁、番茄汁、牛肉膏、土豆勻漿、椰子汁、香蕉勻漿等已經(jīng)被普遍用于蘭花組培培養(yǎng)基的配制。在許多蘭花品種的幼苗培養(yǎng)基中加入有機(jī)添加劑如椰子汁、香蕉勻漿、土豆勻漿對(duì)生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。香蕉提取物富含自然細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素和赤霉素，能促進(jìn)蘭花的數(shù)量和幼苗根系的生長(zhǎng) [20]。在KC培養(yǎng)基中加入香蕉提取物能促進(jìn)石斛單株的根系數(shù)量和長(zhǎng)度。椰子汁包含多種營(yíng)養(yǎng)和激素，經(jīng)過高壓滅菌后與蘭花組培培養(yǎng)基的其他活性物質(zhì)相容性高，能夠刺激愈傷組織或者原球莖的形成，提高細(xì)小片段外植體的存活率，調(diào)整PLB分化過程 [10]。馬生健等比較了不同濃度的椰乳、椰子汁、土豆勻漿和香蕉勻漿對(duì)蝴蝶蘭PLB增殖的影響。結(jié)果表明，對(duì)蝴蝶蘭PLB增殖效果總體影響由好至差依次為椰乳、椰子汁、土豆勻漿和香蕉勻漿 [21]。

3 存在問題和展望

在組培快繁過程中，仍存在一些問題，組培快繁技術(shù)體系仍需完善。受消毒過程困難、容易褐化、外植體滲出液有毒害和植物組織自身抵抗等因素的限制，蘭花無(wú)菌快繁的污染難以控制，仍需要探索標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程。蘭花無(wú)菌苗的移栽成活率低。雖然通過反蒸發(fā)應(yīng)用如加入ABA或是通過增加CO2濃度提高光合作用率減少蒸發(fā)率，或者通過改善培養(yǎng)基的組成如加入有機(jī)質(zhì)（椰殼絲、刨花）提高基質(zhì)效力，覆蓋苔蘚增加地表水分保留能力等措施獲得較高的成活率，但從無(wú)菌環(huán)境到溫室或者大田環(huán)境，大量的組培快繁苗無(wú)法存活，因此要實(shí)現(xiàn)幼苗從組培容器到自然環(huán)境的順利過渡，提高存活率還需要不斷探索。另外，高濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)會(huì)引起蘭花離體培養(yǎng)變異，但確切的突變?cè)?，仍待進(jìn)一步研究 [22]。以組培快繁為基礎(chǔ)，結(jié)合分子生物學(xué)，在開展蘭花的綜合育種、保存或工業(yè)化生產(chǎn)方面具有廣闊的前景。

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