張春平,李 立,陳亦明,李 旺,王海雷 (.昆明醫(yī)科大學(xué),云南 昆明 65003;.昆明市第一人民醫(yī)院,云南 昆明65000)
近年來(lái),miRNA以其特有的基因、生物學(xué)特性及潛在的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值,在治療各項(xiàng)難治性疾病中越來(lái)越引人注意,研究miRNA在膽管上皮細(xì)胞再生修復(fù)中的調(diào)控作用機(jī)制,從而解決膽道并發(fā)癥——“阿格硫斯之踵”醫(yī)學(xué)難題。1993年,LEE等在秀麗新小桿線蟲(chóng)發(fā)育調(diào)控研究中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)miRNA[1],7年后Pasquinelli在對(duì)線蟲(chóng)發(fā)育調(diào)控中發(fā)現(xiàn)了let-7[2]。目前已有500余個(gè)miRNA在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。miRNA在肝膽疾病中對(duì)細(xì)胞凋亡、增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞分化發(fā)育均發(fā)揮著調(diào)控作用,通過(guò)檢測(cè)膽道疾病組織中miRNA的表達(dá)水平情況,了解其調(diào)控的靶基因,進(jìn)而對(duì)膽道疾病進(jìn)行基因水平等進(jìn)一步治療?,F(xiàn)報(bào)告如下。
miRNA是一類(lèi)真核生物內(nèi)源性的小分子單鏈RNA,可對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。miRNA合成產(chǎn)生,首先是在miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄成為一個(gè)具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA復(fù)合體(pri-miRNA),pri-miRNA通常有幾百上千個(gè)核苷酸構(gòu)成,含有帽子和polyA尾巴結(jié)構(gòu),二級(jí)結(jié)構(gòu)呈特殊的發(fā)夾莖-環(huán)結(jié)構(gòu)[3]。然后miRNA復(fù)合體(primiRNA)再被RNA聚合酶III-Drosa-DGCR8復(fù)合體切割加工成為miRNA前體(pre-miRNA),但是莖-環(huán)結(jié)構(gòu)仍被保留,pre-miRNA大小未60-75堿基。pre-miRNA被核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白exportin5轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)pre-miRNA在Dicer酶、ATP和解旋酶的共同作用下,最終分裂成為21-25bp的成熟miRNA。成熟的miRNA通過(guò)與一種類(lèi)似RISC的核糖蛋白結(jié)從而合成miRNP,識(shí)別靶基因從而發(fā)揮生物功能[4]。研究證明miRNA可調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制主要有兩個(gè)方面,一方面是當(dāng)miRNA的序列與靶基因的3'UTR近似完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)則對(duì)互補(bǔ)靶基因進(jìn)行切割,從而使靶基因mRNA降解,不完全匹配則抑制靶基因的mRNA表達(dá),從而發(fā)揮抑制基因表達(dá)甚至沉默的功能,但不影響靶基因的mRNA的穩(wěn)定,不使靶基因降解。另一方面miRNAs可以指導(dǎo)目的靶基因的mRNA快速的脫腺苷化,導(dǎo)致靶基因mRNA快速的衰減和導(dǎo)致其蛋白表達(dá)水平降低,從而達(dá)到基因調(diào)控的目的[5]。
miRNA在肝膽疾病領(lǐng)域中研究進(jìn)展很快,Mir-335的研究中,通過(guò)基因轉(zhuǎn)染敲除目的基因的方法檢測(cè)出膽固醇水平降低[6]。同時(shí)近期研究證明,在肝移植后導(dǎo)致膽道狹窄疾病的相關(guān)研究中,發(fā)現(xiàn)比較冷缺血及熱缺血時(shí)間與miR-222,miR -296,miR -122,miR -148a表達(dá)相關(guān)。[7],同時(shí)在肝再生的研究中發(fā)現(xiàn)在組織缺氧情況下mir-150調(diào)控含量降低,可能負(fù)調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α表皮生長(zhǎng)因子(EGF),促進(jìn)肝再生[8],Meng F等對(duì)酒精性肝損傷的研究發(fā)現(xiàn)mir-34a可能通過(guò)調(diào)控甲基化調(diào)控天冬氨酸酶-2和去乙酰化酶-1,促進(jìn)酒精性肝損傷修復(fù)可能。[9]
肝臟受損再生過(guò)程中,肝臟的卵圓細(xì)胞能夠分化為肝細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞,從而能重建肝小葉結(jié)構(gòu)。研究證明mir-21、mir-221在肝臟受損再生過(guò)程中有著調(diào)節(jié)作用,mir-21在肝臟再生中調(diào)控抑制BTG2,BTG2屬于抗增殖蛋白與PICK1相互作用,同時(shí)研究證明BTG2與蛋白激酶C介導(dǎo)的胞外傳導(dǎo)和細(xì)胞分化也有關(guān)系[10]。程序性細(xì)胞死亡4(PDCD4)基因目前研究與mir-21關(guān)系密切,細(xì)胞的出現(xiàn)凋亡受阻或增殖失控均有可能導(dǎo)致腫瘤形成,PDCD4基因表達(dá)上調(diào)從而控制細(xì)胞凋亡,mir-21可能有著調(diào)控細(xì)胞程序死亡作用調(diào)控 PDCD4[11]。mir- 221 調(diào)控的靶基因?yàn)?P27、P57[12],P27、P57 在細(xì)胞周期中屬蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑,抑制蛋白激酶復(fù)合物的活性,從而調(diào)節(jié)在肝臟受損再生細(xì)胞增殖。同時(shí)研究證明mir-506其作用機(jī)制可能是調(diào)控了AE2,AE2屬于跨膜陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,作用為氯乙烯/碳酸氫鹽交換功能,有著調(diào)節(jié)肝臟膽管膽汁分泌碳酸氫鹽的作用。膽道損傷導(dǎo)致膽汁淤積肝硬化與AE2損傷有關(guān)mir-506在膽道損傷時(shí)明顯上調(diào),從而調(diào)控抑制AE2通路[13],同時(shí)研究表明mir-128在神經(jīng)上皮細(xì)胞調(diào)控SOX9的表達(dá),SOX基因家族調(diào)控生物早期胚胎的發(fā)育過(guò)程[14-15]。研究證明SOX9在肝卵圓細(xì)胞中也有表達(dá)與膽管干細(xì)胞同源,從組織起源論研究,肝臟及膽管的胚胎發(fā)育過(guò)程中均來(lái)源于內(nèi)胚層細(xì)胞,經(jīng)研究證明肝卵圓細(xì)胞在肝臟受損等因素下被激活,在體外試驗(yàn)相關(guān)誘導(dǎo)因素下可分化為膽管上皮細(xì)胞,但組織分布不同,從而為肝卵圓細(xì)胞誘導(dǎo)分化為膽管上皮細(xì)胞的研究可行性和必要性提供有利依據(jù)。
根據(jù)mircoRNA高度保守的在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)基因,在生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用,其在肝膽疾病腫的研究提示其在肝膽疾病的診療有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值。利用pRT-PCR和Northern印跡雜交技術(shù)等,可以檢測(cè)miRNA在相關(guān)疾病細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平,與正常的細(xì)胞表達(dá)水平相比較后,可以得出異常表達(dá)miRNA,從而起到基因治療疾病作用。研究miRNA在膽管上皮細(xì)胞再生修復(fù)中的調(diào)控機(jī)制,可能將對(duì)膽道損傷治療提高至基因治療水平,甚至能找到有效治療膽道損傷的另一方法。同時(shí)miRNA在腫瘤方面也起著至關(guān)重要的作用,通過(guò)篩查患者相關(guān)癌基因,如基因探針、基因敲除或者導(dǎo)入可使癌基因表達(dá)沉默或分解的miRNA,或者導(dǎo)入miRNA后使靶基因mRNA快速的衰減和導(dǎo)致其蛋白表達(dá)水平降低,從而達(dá)到基因調(diào)控的目的。這種穩(wěn)定且低毒特點(diǎn)可能在肝膽疾病的基因治療中發(fā)揮重大作用,綜上所述,miRNA有望成為解決肝膽難治疾病及另外一種有效的治療方法[15]。
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