低溫脅迫下椰心葉甲嚙小蜂正反向消減cDNA文庫的構(gòu)建及其序列分析

呂寶乾， 萬 婕， 李藝瓊， 金啟安， 彭正強(qiáng)

溫海波中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所; 農(nóng)業(yè)部熱帶農(nóng)林有害生物入侵監(jiān)測(cè)與控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部儋州農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，海南 儋州 571737

椰心葉甲嚙小蜂Tetrastichusbrontispae(Ferriere)是入侵害蟲椰心葉甲Brontispalongissima(Gestro)的重要蛹寄生蜂，自2004年從中國臺(tái)灣引入大陸后，在防治椰心葉甲危害上取得了階段性成果。椰心葉甲發(fā)生區(qū)所處緯度較低，主要包括海南全省，廣東、廣西和云南省區(qū)的部分地區(qū)。這些地區(qū)1月份平均氣溫仍有10 ℃，在冬季，受南下冷空氣影響，會(huì)有接近0 ℃的短時(shí)極端低溫天氣。因此，椰心葉甲嚙小蜂耐低溫脅迫能力將決定該寄生蜂是否能在低溫環(huán)境下建立種群并發(fā)揮控害效能。為保護(hù)機(jī)體免受寒害損傷，昆蟲體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列的應(yīng)急性代謝變化。郭東峰(2013)曾對(duì)椰心葉甲嚙小蜂耐寒性做了相關(guān)研究，初步明確其抗寒系統(tǒng)為海藻糖—甘油—脂肪—糖原。為了從分子生物學(xué)角度解釋椰心葉甲嚙小蜂低溫脅迫的內(nèi)在響應(yīng)機(jī)制，本研究利用抑制消減雜交(suppression subtractive hybridization，SSH)技術(shù)篩選椰心葉甲嚙小蜂耐寒相關(guān)基因。

抑制消減雜交技術(shù)是一門被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分化、發(fā)育、衰老等領(lǐng)域，旨在分離不同組織間或個(gè)體發(fā)育的不同階段以及因外界因子作用而導(dǎo)致差異表達(dá)基因的技術(shù)(張鍇, 2010)，由Diatchenkoetal.(1996)首次提出，該技術(shù)操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠、靈敏性高，因此在動(dòng)植物研究中，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。郭新紅和姜孝成(2001)利用SSH證實(shí)了甘露醇處理后的梭梭Halonxylonammodendron(Men.) Bge.幼苗中有3個(gè)特異表達(dá)或表達(dá)增強(qiáng)的基因；Wang & Rowley(1998)利用SSH分離得到水稻OryzasativaL.經(jīng)硝酸鹽脅迫下誘導(dǎo)的基因；王衍海等(2006)采用SSH從日本吸血蟲SchistosomajaponicumKatsurada雌蟲體內(nèi)篩選出了6個(gè)表達(dá)水平明顯高于雄蟲的基因；梁利群等(2006)采用SSH明確了鯉魚CyprinuscarpioL.腦組織里13個(gè)低溫下特異表達(dá)的未知基因；季相華(2008)利用SSH分離并鑒定了稻水象甲LissorhoptrusoryzophilusKuschel夏季滯育的相關(guān)基因；陳浩等(2012)利用SSH分離和鑒定了梨小食心蟲Grapholithamolesta(Busck) 滯育的相關(guān)基因等。本試驗(yàn)利用抑制雜交消減技術(shù)研究了低溫處理(0 ℃下處理24 h)后椰心葉甲嚙小蜂體內(nèi)差異基因的表達(dá)情況，分離并獲得與椰心葉甲嚙小蜂耐寒相關(guān)基因，為揭示其耐寒性機(jī)理提供重要線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試?yán)ハx 椰心葉甲嚙小蜂由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所椰心葉甲天敵飼養(yǎng)室提供，以椰心葉甲蛹為寄主進(jìn)行繁殖，正常飼養(yǎng)條件下(25 ℃，RH=75%±10%，L∶D=12∶12)飼養(yǎng)的試蟲為對(duì)照組，0 ℃下處理24 h的試蟲為處理組。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 TRIZOL RNA抽提試劑(INVIROGEN廠),DNTP三磷酸脫氧核苷(大連寶生物工程有限公司)，Taq酶(KAPA),TBE緩沖液(華大科技)，10×Loading buffer(華大科技)，DNA Marker(華大科技)，QIAGEN ⅡGel Extraction Kit Qiagen(QIAGEN公司)，PMD-18T載體(大連寶生物工程有限公司)，SSH試劑盒(CLONTECH公司)，其他常規(guī)生化試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA抽提 按照TRIZOL試劑盒說明書分別提取處理組與對(duì)照組試蟲總RNA，用NANO DROP分光光度計(jì)測(cè)濃度并定量后，組建2個(gè)總RNA庫，將總RNA適當(dāng)稀釋，取1 μL用NANO FROP測(cè)濃度并定量。

1.2.2 抑制消減雜交 以處理組作tester，對(duì)照組作driver進(jìn)行正向雜交，富集處理組高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本；以對(duì)照組作tester，處理組作driver進(jìn)行反向雜交，富集對(duì)照組高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本。按照PCR-SelectTM cDNA Subtration kit說明，分別合成cDNA第一鏈與雙鏈cDNA并純化。將所有tester cDNA酶切后分為2份，分別與接頭l(Adaptor l)與2R(Adaptor 2R)連接，制成tester cDNA 1和tester cDNA 2，16 ℃過夜處理后，分別與driver cDNA在68 ℃下進(jìn)行第1次雜交，8 h后，向第1次消減雜交的混合體系中加入過量變性driver進(jìn)行第2次雜交，68 ℃過夜處理。雜交產(chǎn)物經(jīng)稀釋后取1 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系除雜交產(chǎn)物外還包括：5 μL H2O，35.5 μL MgCl2(KAPA)，5 μL 10×buffer(KAPA)，1 μL dNTP(10 mmol/each),1 μL Primer l (up 50 pmol·μL-1),1 μL Primer l (down 50 pmol·μL-1)和0.5 μLTaq(5 U·μL-1)，總體積50 μL。將第1次PCR產(chǎn)物稀釋后取1 μL，加入與第1次PCR擴(kuò)增相同的其他反應(yīng)體系，進(jìn)行第2次PCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體積50 μL。

1.2.3 消減cDNA文庫的構(gòu)建及插入片段的初步鑒定 將正反向消減雜交產(chǎn)物利用QIAGEN ⅡGel Extraction Kit Qiagen膠回收試劑盒(QIAGEN公司)分別過柱純化，與PMD-18T載體連接，完成正反向消減cDNA文庫的構(gòu)建。轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichiacoli感受態(tài)細(xì)胞DH5a，涂布在含有90 mm AMP的LB平板中，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑選轉(zhuǎn)化了的單菌落，1 mL LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，取20 μL菌液離心后作為模板，加入與前2次PCR擴(kuò)增相同的其他反應(yīng)體系進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.4 部分EST(expression sequence tag)片段序列分析 隨機(jī)挑選500個(gè)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。所測(cè)序列與Genbank(http：∥www.ncbi.nlm.gov)中的序列進(jìn)行比對(duì)，并進(jìn)行同源性檢索和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取、雙鏈cDNA的合成及選擇性擴(kuò)增

高純度和完整的總RNA是構(gòu)建cDNA文庫的前提條件。本試驗(yàn)中提取的處理組與對(duì)照組總RNA電泳結(jié)果如圖1所示，28S、18S 2條帶清晰可見，表明提取的RNA完整性好。處理組與對(duì)照組樣品的A260 nm/A280 nm分別為1.81和1.88，二者均介于1.8～2.0之間，符合建庫要求。

2.2 椰心葉甲嚙小蜂cDNA的2次差減雜交和2次抑制性PCR

2次消減雜交后的PCR結(jié)果如圖2所示。由于第1次PCR擴(kuò)增條帶不明顯，故進(jìn)行第2次PCR檢測(cè)，第2次PCR產(chǎn)物電泳下產(chǎn)生了連續(xù)的條帶，且大小片段介于200～700 bp，說明檢測(cè)子中的差異表達(dá)基因得到了有效富集與擴(kuò)增。

2.3 抑制消減cDNA文庫的構(gòu)建

取110 μL轉(zhuǎn)化菌涂于平板，庫1與庫2分別得到498與524個(gè)白色克隆，克隆飽滿清晰。隨機(jī)選取24個(gè)陽性克隆培養(yǎng)，取菌液進(jìn)行PCR檢測(cè)。如圖3所示，95%以上的陽性克隆cDNA插入片段大小在200～700 bp之間，且都能檢測(cè)到明顯條帶。

圖1 處理組與對(duì)照組試蟲總RNA檢測(cè)Fig.1 Total RNA of T.brontispae from control and treatment group 1： 處理組； 2： 對(duì)照組。1: Treatment group; 2: Control group.

圖2 正反文庫抑制差減雜后第2次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of products before and after SSHM: DNA marker; 1: 以處理組為tester，對(duì)照組為driver,經(jīng)過SSH過程的PCR產(chǎn)物； 2： 以對(duì)照組為driver，處理組為tester，經(jīng)過SSH過程的PCR產(chǎn)物。M： DNA marker; 1： PCR products using treatment group as tester, control group as driver; 2: PCR products using control group as tester, treatment group as driver.

2.4 EST片段的測(cè)序和同源性分析

在PCR鑒定為陽性克隆的正向文庫中挑選224個(gè)菌落，從反向文庫中挑選119個(gè)菌落測(cè)序，分別獲得40與4個(gè)高質(zhì)量ESTs。正向文庫檢測(cè)的序列是在誘導(dǎo)條件下表達(dá)量上調(diào)的基因，反向文庫檢測(cè)的序列是在誘導(dǎo)條件下表達(dá)量下調(diào)的基因。將這些ESTs通過Genbank進(jìn)行序列比對(duì)分析(Blastx)。結(jié)果表明，與抗寒相關(guān)的EST表達(dá)不僅涉及不同物種，其中包括植物、動(dòng)物及微生物(表1)，表1主要列舉了同源性高達(dá)80%以上昆蟲種類的功能基因，這些功能基因的來源也很廣泛，主要包括新陳代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能、氨基酸和蛋白質(zhì)的合成、以及某些未知的功能基因，并列出了可能與嚙小蜂耐寒機(jī)制有關(guān)聯(lián)的候選基因。

圖3 正反文庫部分陽性克隆插入片段大小的檢測(cè)Fig.3 Identification of inserted cDNA fragments from forward and reverse suppression cDNA librariesA： 正向文庫； B： 反向文庫； M： DNA marker； 1～24： 從正反向文庫中隨機(jī)挑取的24個(gè)克隆陽性。A: Forward suppression cDNA library; B: Reverse suppression cDNA library; M: DNA marker; 1～24: The 24 randomly picked clones from the suppression cDNA libraries.

類別Catalogue克隆Clone登錄號(hào)Accession No.同源序列的基因功能及來源Name of proteins/genes and source長(zhǎng)度Length(bp)E值E-value新陳代謝MetabolismF1-38ERH70282.1蔗糖結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的ATP結(jié)合蛋白,靈桿菌EGD-HP20Sugar ABC transporter ATP-binding protein, Serratia marcescens Bizio EGD-HP22372e-47F1-1-42ABN12066.1預(yù)測(cè)的 ATP 合成酶β亞基,木槿曼粉蚧Predictive ATP synthase subunit β, Maconellicoccus hirsu-tu4326e-93F1-2-5WP015378317.1β-酮己二酰輔酶A硫解酶,粘質(zhì)沙雷菌β-ketoadipyl CoA thiolase, Serratia marcescen Bizio2281e-36

續(xù)表1

類別Catalogue克隆Clone登錄號(hào)Accession No.同源序列的基因功能及來源Name of proteins/genes and source長(zhǎng)度Length(bp)E值E-value信號(hào)傳導(dǎo)Signal transductioF1-2-38EFN66498.15'-磷酸腺苷酸活化的蛋白激酶催化亞基α-2 ,佛羅里達(dá)弓背蟻5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit α-2, Camponotus floridanu Buckley3794e-59F2-90BAF03050.1細(xì)胞粘附分子AbsCAM-Ig7B,意大利蜜蜂Cell adhesion molecule AbsCAM-Ig7B, Apis mellifer L.3172e-34細(xì)胞結(jié)構(gòu)Cell structureF1-1-8ABB45785.1α-微管蛋白,共生菌Streblomastix strixα-tubulin, Streblomastix strix1543e-29F2-19AGJ71765.1原肌球蛋白, 部分源于菊花和葉蟬Tropomyosin, partial Chrysanthemum morifolium Ramat and Euscelidius variegatus Kirshbaum1368e-04F2-46ACC66067.1肌動(dòng)蛋白,琥珀蠶Actin, Antheraea assam Westwood2091e-41F1-21EFN83272.1肌聯(lián)蛋白,印度跳蟻Titin, Harpegnathos saltato Jerdo1273e-16F2-95EFN89426.1接頭蛋白復(fù)合體mu-1,印度跳蟻AP-2 complex subunit mu-1, H.saltato1752e-31F2-72ABJ09674.1尼古丁乙酰膽堿受體的6號(hào)亞基的同型蛋白Ⅶ,家蠅Nicotinic acetylcholine receptor subunit 6 isoform Ⅶ, Mus-ca domestic L.2860.020F1-1-10NP001165851.1圍食膜因子3-A2前體樣表皮蛋白3-A2,麗蠅蛹集金小蜂Cuticular protein analogous to peritrophins 3-A2 precursor, Nasonia vitripenni (Walker)1821e-29F2-27NP001166263.1RR-1家族18號(hào)表皮蛋白前體,麗蠅蛹集金小蜂Cuticular protein RR-1 family member 18 precursor, N.vitrip-enni1292e-14轉(zhuǎn)錄調(diào)控Transcriptional con-trolF2-1BAA19776.1聚合酶蛋白,家蠶Pol protein, Bombyx mor L.3606e-31F2-91EFN82019.1組蛋白去甲基化酶UTX,印度跳蟻Histone demethylase UTX, H.saltato3121e-69F2-14EGI57453.1核內(nèi)蛋白1,切葉蟻Nuclear protein 1, Acromyrmex echinatior (Forel)6532e-26R2-2-2EHJ63313.1逆轉(zhuǎn)錄酶,大紅斑蝶Reverse transcriptase, Danaus plexippu L.1172e-08與耐寒性相關(guān)的候選基因F2-10CAJ28988.1熱激蛋白83,地中海果蠅Heat shock protein 83, Ceratitis capitat (Wiedemann)1342e-21Candidate genes may be related to cold toler-anceF1-1-48ABV48741.1熱激蛋白70同源類別(Hsc70),熊蜂蒺藜Heat shock protein cognate 70, Bombus terrestri L.2054e-41F2-24ACO57619.1熱激蛋白60,蝶蛹金小蜂Heat shock protein 60, Pteromalus puparu L.4685e-63F1-1-50AFC76152.1熱激蛋白90,刺桐姬小蜂Heat shock protein 90, Quadrastichus erythrina Kim7631e-34F1-2-31ACO58580.1熱激蛋白90,意大利蜜蜂Heat shock protein 90, A.mellifer2217e-40F2-63WP028472695.1海藻糖磷酸合酶, 耐堿類諾卡氏菌Trehalose-phosphate synthase, Nocardioides alkalitoleran sp.nov.1992e-04F1-2-7NP001164445.1谷氨酰胺合成酶,意大利蜜蜂Glutamine synthetase, A.mellifer1171e-09F1-1-29XP003627732.1ATP 合成酶β亞基,蒺藜苜蓿ATP synthase subunit β, Medicago truncatul Gaertn.3362e-39F1-1-41NP001165787.1NADH 脫氫酶(輔酶)1-α亞復(fù)合體9, 39 kD,麗蠅蛹集金小蜂NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1-α subcomplex 9, 39 kD, N.vitripenni2873e-52氨基酸和蛋白質(zhì)的合成Synthesis of amino acids F1-1-25AAX62421.1核糖體蛋白L3,茶足柄瘤蚜繭蜂Ribosomal protein L3, Lysiphlebus testaceipe (Cresson)4699e-101and proteinsF1-2-37AAR01309.1延伸因子2,美洲大蠊Elongation factor 2, Periplaneta american L.6461e-143

續(xù)表1

類別Catalogue克隆Clone登錄號(hào)Accession No.同源序列的基因功能及來源Name of proteins/genes and source長(zhǎng)度Length(bp)E值E-valueF2-38ABX57482.1核糖體蛋白S2,環(huán)眼蝶Ribosomal protein S2, Pararge aegeri L.1291e-18F1-2-12ACZ13616.1谷氨酰胺-tRNA合成酶,嗜線蟲桿菌Glutamyl-tRNA synthetase, Xenorhabdus indic sp.nov.2242e-45F1-2-28EFN62653.1延伸因子2,佛羅里達(dá)弓背蟻Elongation factor 2, C.floridanu3216e-67F2-43CBY32249.1未命名蛋白產(chǎn)物,異體住囊蟲Unnamed protein product, Oikopleura dioic2152e-41F2-22EGI68302.140S核糖體蛋白S29,切葉蟻40S ribosomal protein S29, Acromyrmex echinatio (Forel)1125e-17F2-15AGW44856.1延伸因子1-α, 部分源自 Telenomus consimilisElongation factor 1-α, partial Telenomus consimili1862e-34F2-52EZA54050.160S核糖體蛋白L19,畢氏粗角蟻60S ribosomal protein L19, Cerapachys biro (Forel)2053e-35F2-94EZA50841.160S核糖體蛋白L13a,畢氏粗角蟻60S ribosomal protein L13a, C.biro1171e-09F2-13ABD36171.1多毛細(xì)胞白血病蛋白1,家蠶Hairy cell leukemia protein 1, B.mor3496e-43F2-3NP476874.1EHJ核糖體蛋白S2, 黑腹果蠅Ribosomal protein S2, Drosophila melanogaste Meige4174e-89R2-2-16EHJ77067.1聚合酶蛋白,黑腹果蠅Pol protein, D.melanogaste1678e-12未知功能Unknown proteinsF1-2-13EGI67437.1假設(shè)蛋白G5I_04082,切葉蟻Hypothetical protein G5I_04082, A.echinatio2131e-41R2-2-46EZA46989.1THAP結(jié)構(gòu)域蛋白,畢氏粗角蟻THAP domain-containing protein, C.biro3171e-17F2-6XP001599602.1預(yù)測(cè): 40S核糖體蛋白S10,麗蠅蛹集金小蜂Predicted: 40S ribosomal protein S10, N.vitripenni2131e-41F2-9XP008209404.1預(yù)測(cè): 谷氧還蛋白C4-異構(gòu)體X1,麗蠅蛹集金小蜂Predicted: glutaredoxin-C4-like isoform X1, N.vitripenni2782e-42

F： 正向文庫EST； R： 反向文庫EST。

F: EST sequences of forward suppression library; R: EST sequences of reverse suppression library.

3 討論

大多數(shù)亞熱帶、熱帶昆蟲，由于較少經(jīng)歷0 ℃及以下低溫，冬季來臨時(shí)，低溫在其體內(nèi)易造成“不結(jié)冰冷傷害”(nonfreezing cold injury, NFCI)。為建立新的代謝過程以維持正常的生命活動(dòng)，昆蟲體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列的生理變化。本試驗(yàn)對(duì)椰心葉甲嚙小蜂低溫耐寒相關(guān)的SSH-cDNA正反向文庫EST序列進(jìn)行功能分類，結(jié)果表明，差異表達(dá)的基因主要與新陳代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能、氨基酸和蛋白質(zhì)的合成等生理過程有關(guān)，從中篩選出與嚙小蜂耐寒性相關(guān)基因共5類。①Hsp家族蛋白，包括Hsp60、Hsc70(Hsp70的另一表現(xiàn)型)、Hsp83和Hsp90。其中，Hsp90蛋白能快速保護(hù)細(xì)胞對(duì)抗內(nèi)外源性應(yīng)激原的刺激，增強(qiáng)細(xì)胞的修復(fù)功能及提高細(xì)胞對(duì)應(yīng)激的耐受程度(李娟等, 2008)；Hsp70在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中扮演著重要的分子伴侶角色，且在低溫暴露條件下與變性蛋白質(zhì)的復(fù)性過程相關(guān)(Feder & Hofmann, 1999; Sinclairetal., 2007)；Hsp83在昆蟲卵巢發(fā)育期間起重要的保護(hù)作用，Xuetal.(2010)發(fā)現(xiàn)，Hsp83的表達(dá)若受到抑制，赤擬谷盜TriboliumcastaneumHerbst雌蟲就無法產(chǎn)出成熟的卵細(xì)胞；Hsp60與能量代謝過程中酶和蛋白質(zhì)的組裝有關(guān)，在脅迫環(huán)境下，Hsp60的增加會(huì)使受損的蛋白質(zhì)復(fù)性并恢復(fù)其生物活性(Chengetal., 1989; Martinetal., 1992)。②海藻糖磷酸合酶(trehalose-phosphate synthase，Tps)，雖未直接報(bào)道在諾卡氏菌上與其耐寒性相關(guān)，但海藻糖是昆蟲在面臨高低溫、干燥、氧化等外界脅迫環(huán)境時(shí)體內(nèi)普遍誘導(dǎo)的一種具保護(hù)作用的二糖，有昆蟲“血糖”之稱(Thompson, 2003)，Tps可誘導(dǎo)海藻糖的形成(Chung, 2008)，而海藻糖正是椰心葉甲嚙小蜂耐寒系統(tǒng)的主要物質(zhì)之一(郭東峰, 2013)。③谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase)，雖未報(bào)道在意大利蜜蜂體內(nèi)與其耐寒性直接相關(guān)，但谷氨酰胺合成酶與麻蠅SarcophagacrassipalpisMacquart耐寒性相關(guān)(Michaud & Denlinger, 2007)；④ATP合酶β亞基(ATP synthase subunit β)，與竹節(jié)蟲屬M(fèi)icrarchus耐寒性狀的表達(dá)相關(guān)(Dunningetal., 2014)。⑤NADH脫氫酶，與水稻耐寒性狀的表達(dá)相關(guān)(Yanetal., 2006)。

本文對(duì)進(jìn)一步研究椰心葉甲嚙小蜂抗寒性狀的表達(dá)具有一定的參考價(jià)值，對(duì)揭示該蜂耐寒機(jī)制的探索打下一定的基礎(chǔ)，但就本試驗(yàn)獲得的所有EST序列及其實(shí)際功能，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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