我國西花薊馬線粒體DNA-COⅠ基因變異及群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

張桂芬， 喬瑋娜， 古君伶， 閔 亮， 萬方浩

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2農(nóng)業(yè)部外來入侵生物預(yù)防與控制研究中心，北京100193； 3北京市順義區(qū)植保植檢站，北京101300

西花薊馬Frankliniellaoccidentalis(Pergande)，又稱苜蓿薊馬alfalfa thrips，屬薊馬科Thripidae花薊馬屬Frankliniella，原產(chǎn)于加拿大西部和美國北部，最早記載于1895年，是美國加利福尼亞州的常見害蟲(Beshear, 1983)。隨著加州花卉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，西花薊馬隨花卉及其產(chǎn)品的銷售，擴(kuò)散蔓延至賓夕法尼亞州(1966年)、堪薩斯州(1971年)、北卡羅來納州(1977年)、路易斯安那州(1983年)等地(任潔, 2006)。迄今，西花薊馬已遍布美國50個(gè)州(Rugman-Jonesetal., 2010)。同時(shí)，隨著國際貿(mào)易往來的日趨頻繁，該蟲隨花卉和蔬菜的遠(yuǎn)距離運(yùn)輸迅速向世界各地?cái)U(kuò)散。1983年，西花薊馬首次在荷蘭溫室的非洲堇SaintpauliaionanthaWendl上被發(fā)現(xiàn)，而后迅速在歐洲南部地區(qū)建立種群(Brodsgaard, 1993; Kirk & Terry 2003; Vierbergen, 1999)。之后，該薊馬又先后在以色列(1987年)(Argamanetal., 1989)、南非(1987年)(Giliomee, 1989)、馬來西亞(1989年)(Fauziah & Saharan, 1991)、日本(1990年)(Hayase & Fukuda, 1991)、澳大利亞(1993年)(Malipatiletal., 1993)、韓國(1994年)(Chungetal., 2000)等國發(fā)現(xiàn)，并在局部地區(qū)造成嚴(yán)重危害。目前，西花薊馬已成為世界范圍內(nèi)嚴(yán)重制約蔬菜、花卉、果樹等產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要害蟲之一(Gerinetal., 1994; Kirk & Terry, 2003)。

早在1997年，我國就將西花薊馬列入《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫潛在危險(xiǎn)性病、蟲、雜草名錄(試行)》[動(dòng)植檢植字(1997)33號(hào)]。我國于2003年7月在北京郊區(qū)的溫室辣椒上發(fā)現(xiàn)西花薊馬(張友軍等，2003)，之后又在云南(2005年)(徐家菊等, 2005)、貴州(2006年)(袁成明等, 2008)、山東(2007年)(鄭長英等, 2007)、黑龍江(2007年)(武曉云等, 2009)、湖南(2008年)(劉佳等, 2010)、南京(2008年)(嚴(yán)丹侃等, 2010)、新疆(2010年)(楊華等, 2010)、西藏(2012)(王海鴻等, 2013)等地相繼有西花薊馬發(fā)生的報(bào)道。

以往的研究顯示，西花薊馬有2個(gè)品系，即溫室品系(glasshouse strain)和羽扇豆品系(lupin strain)(Brunner & Frey, 2010; Rugman-Jonesetal., 2010)。其中，溫室品系源于美國加利福尼亞州，20世紀(jì)80年代，西花薊馬從美國傳入荷蘭溫室蔬菜和花卉集散地后，迅速向整個(gè)歐洲和非洲南部蔓延，在當(dāng)?shù)匦纬煽顾幮暂^強(qiáng)的溫室品系(Kirk & Terry, 2003)。羽扇豆品系源于新西蘭，早在19世紀(jì)30年代從美國加利福尼亞州隨羽扇豆傳入新西蘭(Kirk & Terry, 2003; Martin & Workman, 1994)，只危害羽扇豆類植物，對其他作物沒有危害(Martin & Workman, 1994)；20世紀(jì)90年代，羽扇豆品系傳至整個(gè)美國北部和加拿大南部(Kirk & Terry 2003; Rugman-Jonesetal., 2010)。有研究顯示，西花薊馬的2個(gè)品系在體色、抗寒性、抗藥性等方面均有很大區(qū)別(Fellandetal.,1993; Kirk & Terry, 2003; Martin & Workman, 1994; Tsumukietal., 2007)。

入侵害蟲的遺傳多樣性及其擴(kuò)張趨勢研究，是入侵生物學(xué)的重要研究內(nèi)容之一(萬方浩等, 2005)。Fangetal.(2005)利用AFLP(amplified fragment length polymorphisim)技術(shù)分析以色列不同地理種群西花薊馬的遺傳結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)各種群內(nèi)部具有很高的遺傳多樣性。張治軍(2007)利用該技術(shù)研究西花薊馬7個(gè)不同地理種群(北京、云南、新西蘭、荷蘭、美國、澳大利亞和日本)，分析結(jié)果表明，不同地區(qū)的西花薊馬種群之間存在明顯的遺傳分化；聚類分析結(jié)果顯示，北京種群與荷蘭種群聚為一支，推測北京的西花薊馬可能來自荷蘭。沈榮登等(2011)應(yīng)用核糖體DNA中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS2(internal transcribed spacer 2)基因序列對云南各地理種群西花薊馬的遺傳結(jié)構(gòu)及其分化進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明各地理種群間的遺傳分化程度很低，種群間存在基因交流。

本研究針對西花薊馬在我國傳播擴(kuò)散迅速但其遺傳結(jié)構(gòu)尚不明晰的問題，以采自我國13個(gè)地理區(qū)域的西花薊馬為靶標(biāo)，采用COⅠ分子標(biāo)記技術(shù)，研究分析我國西花薊馬不同地理種群的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性，研究結(jié)果對深入探討我國西花薊馬的入侵來源、傳播擴(kuò)散途徑及其有效阻截具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

根據(jù)入侵物種傳播擴(kuò)散的可能途徑以及我國各省/直轄市工農(nóng)業(yè)發(fā)展的特點(diǎn)，以我國經(jīng)濟(jì)比較發(fā)達(dá)的沿海城市、旅游勝地以及礦產(chǎn)資源比較豐富的地區(qū)為主要采集區(qū)域，進(jìn)行西花薊馬的系統(tǒng)采集。本研究中，供試西花薊馬樣品的采集信息如表1所示。

表1 不同地理種群西花薊馬采集信息Table 1 Collecting information of F.occidentalis from different geographical populations

*中國主要外來入侵昆蟲DNA條形碼識(shí)別系統(tǒng)。

*Database of invasive alien species in China (http:∥www.chinaias.cn).

1.2 總DNA提取

西花薊馬總DNA的提取參照Moritzetal.(2001)的方法并稍加改進(jìn)。用軟毛毛筆輕輕挑取單頭薊馬，放在滴有20 μL提取緩沖液(50 mmol·L-1Tris-HCl, 1 mmol·L-1EDTA, 1% SDS, 20 mmol·L-1NaCl, pH 8.0)的Parafilm膜上，以0.2 mL PCR管底部作為勻漿器，充分研磨，勻漿液移入1.5 mL離心管；用50 μL緩沖液清洗勻漿器和Parafilm膜4次，移入同一離心管；加入5 μL蛋白酶K(20 mg·mL-1)，充分混勻后于60 ℃水浴1 h(中途混勻1次)；加入220 μL氯仿/異戊醇(v∶v=24∶1)，輕柔混勻數(shù)十次后，冰浴30 min；以4 ℃、12000 r·min-1離心20 min，取上清液(約200 μL)并加入440 μL預(yù)冷無水乙醇，輕輕混勻后在-20 ℃冰箱放置30 min；取出后，于4 ℃、12000 r·min-1離心20 min，棄去上清液；加入440 μL預(yù)冷75%乙醇洗滌，4 ℃、12000 r·min-1離心15 min，棄去上清液。將離心管倒扣于潔凈濾紙上，自然干燥20 min，每管加入20 μL超純水，充分溶解后于-20 ℃保存?zhèn)溆?。以生物分光光度?jì)測定DNA濃度，以D260 nm/D280 nm值確定其是否被污染。

1.3 PCR擴(kuò)增、電泳檢測以及序列測定

COⅠ基因序列擴(kuò)增所使用的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)引物L(fēng)CO1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)(Folmeretal., 1994)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25 μL，其中模板DNA 2 μL(約500 ng)，10×buffer(含Mg2+)2 μL，dNTPs(0.2 mmol·L-1)0.5 μL，上游引物和下游引物(5 pmol·L-1)各0.5 μL，Taq DNA聚合酶(1.0 U)0.2 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；30個(gè)循環(huán)：94 ℃ 30 s，48 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s；最后72 ℃延伸7 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加2 μL上樣緩沖液(0.25%溴酚蘭，40%蔗糖水溶液)，以DNA Marker為參照，在含有染色劑GoldView的1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離(電泳液為0.5×TBE)，85 V電泳45 min后，以GelDoc Universal Hood Ⅱ型凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。將經(jīng)電泳檢測驗(yàn)證合格的PCR產(chǎn)物送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序(單向測序)。根據(jù)標(biāo)本數(shù)量及PCR產(chǎn)物的質(zhì)量，每個(gè)地理種群檢測西花薊馬5～25頭(表1)，共計(jì)檢測175頭，并將175條序列錄入中國主要外來入侵昆蟲DNA條形碼識(shí)別系統(tǒng)(http:∥www.chinaias.cn)(表1)。

1.4 序列分析

1.4.1 序列校對及人工比對 Bioedit軟件讀取COⅠ基因序列，對每條序列的堿基進(jìn)行人工讀取和反復(fù)校對。校正后的堿基序列在NCBI上進(jìn)行同源性比對，以確保所獲得的序列為目的基因片段。

1.4.2 遺傳多樣性分析 應(yīng)用DnaSP 5.0(Librado & Rozas, 2009)和MEGA 4.0軟件(Kumaretal., 2008)分析西花薊馬各地理種群COⅠ基因的序列特征及單倍型多樣性(haplotype diversity,Hd)。

序列特征分析主要包括序列的多態(tài)性位點(diǎn)(variable/polymorphic sites, V)、堿基組成(base composition)、轉(zhuǎn)換(transition, Ti)和顛換(transversion, Tv)位點(diǎn)數(shù)、轉(zhuǎn)換/顛換偏倚率(Ti/Tv bias, R)。多態(tài)性位點(diǎn)包括自裔位點(diǎn)(singleton variable sites, Si)和簡約信息位點(diǎn)(parsimony informative sites, Pi)。在DNA序列中，堿基恒定的位點(diǎn)和只出現(xiàn)一次變異的位點(diǎn)即為自裔位點(diǎn)；至少有2種變異類型在該位點(diǎn)出現(xiàn)2次或2次以上的，稱為簡約信息位點(diǎn)。堿基組成主要是指，DNA序列中4種堿基A、T、C、G的相對含量。堿基的替換方式有2種，即轉(zhuǎn)換和顛換，A與G之間或者C與T之間的替換稱為轉(zhuǎn)換，A、G與C、T之間的替換稱為顛換。

單倍型多樣性是指在給定群體中隨機(jī)抽取到2個(gè)不同單倍型的頻率，單倍型多樣性高的種群說明其遺傳多樣性高，遺傳資源豐富。核苷酸多樣性(nucleotide diversity,π)是指在給定群體中隨機(jī)選取的COⅠ基因序列間的平均每個(gè)位點(diǎn)的核苷酸差異數(shù)目，是衡量一給定群體遺傳多態(tài)性的重要指標(biāo)，π值越大，種群的多樣性程度越高(彭奕欣和黃詩箋, 1997)。應(yīng)用DnaSP 5.0軟件分析各地理種群的單倍型多樣性和核苷酸多樣性(Librado & Rozas, 2009)，同時(shí)進(jìn)行Tajima′s D中性檢驗(yàn)，以明確其是否遵循中性模型(Tajima, 1989)。

1.4.3 遺傳分化和基因流分析 固定指數(shù)(genetic fixations index,Fst)表示不同種群間等位基因頻率的變異，是反映種群進(jìn)化歷史的重要參數(shù)，可在一定程度上揭示種群間基因流和遺傳漂變的程度?；蛄?gene flow,Nm)指基因在種群內(nèi)和種群間的運(yùn)動(dòng)(Grant, 1985)，包括基因從一個(gè)種群到另一種群成功運(yùn)動(dòng)的所有機(jī)制(Slatkni, 1985)?；蛄骺山沂救后w間可能的基因滲透及影響遺傳分化的遺傳現(xiàn)象?；蛄髟酱?，群體間的相似性越大。固定系數(shù)與基因流之間的關(guān)系為Nm=1/(Fst+1)(Hmailton, 1999)。應(yīng)用DnaSP 5.0軟件(Librado & Rozas, 2009)計(jì)算各地理種群間的固定指數(shù)和基因流。

固定指數(shù)Fst和基因流Nm是表示種群遺傳分化程度的重要指標(biāo)。Fst值越大，表明遺傳分化越明顯，Nm值與之相反，Nm值越大說明種群間基因交流越充分，遺傳分化越小。00.25，種群間分化明顯；Fst值為負(fù)數(shù)，表示2個(gè)種群之間沒有遺傳分化(Balloux & Lugon-Moulin, 2002)。Nm<1，說明群體可能由于遺傳漂變而發(fā)生了分化；Nm>1，表明群體間的基因交流水平較高，群體間遺傳分化較??；Nm>4，種群間的基因交流更為充分，遺傳分化更??；Nm值為負(fù)數(shù)，表示2個(gè)種群間無基因交流(Allendorf, 1983; Millar & Libby, 1991)。

分子變異分析(analysis of molecular variance, AMOVA)是在分子水平上分析種群遺傳結(jié)構(gòu)的工具(Excoffieretal., 2005)，根據(jù)單倍型或基因型間的進(jìn)化距離(evolutionary distance)對各種群間的遺傳差異進(jìn)行等級(jí)劃分，AMOVA具有分子數(shù)據(jù)便于直接計(jì)算離差方的優(yōu)點(diǎn)，本研究應(yīng)用Arlequin 3.0軟件進(jìn)行分子變異分析(Excoffieretal., 2005)。

1.4.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 采用MEGA 4.0軟件按照Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算系統(tǒng)發(fā)育重建所需的遺傳距離(Kumaretal., 2008)，以鄰接法(neighbor-joining method, NJ)構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)育樹分支的置信度采用自展法(bootstrap analysis, BP)重復(fù)檢測1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增、序列測定及同源性分析

以每個(gè)地理種群的單頭西花薊馬DNA為模板，通用型引物L(fēng)CO1490/HCO2198進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測結(jié)果顯示，每個(gè)地理種群的西花薊馬均可擴(kuò)增出清晰的靶標(biāo)片段(長度約為690 bp)(圖1)。對電泳檢測驗(yàn)證合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和序列測定，得到西花薊馬13個(gè)地理種群共計(jì)175條COⅠ基因序列。將所有序列采用ClustalX軟件比對，修剪成長度為631 bp的標(biāo)準(zhǔn)片段進(jìn)行分析。利用NCBI中的BLAST程序進(jìn)行同源性比對，結(jié)果顯示與數(shù)據(jù)庫中已公開的西花薊馬COⅠ基因序列的同源性為99%～100%，表明所獲得的西花薊馬的COⅠ基因序列準(zhǔn)確可靠。

圖1 引物L(fēng)CO1490/HCO2198對不同地理種群西花薊馬COⅠ基因擴(kuò)增結(jié)果電泳檢測圖Fig.1 Amplification pattern of the COⅠ gene of F.occidentalis from 13 geographical populations using the universal primers LCO1490/HCO2198M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～13:西花薊馬不同地理種群，編號(hào)同表1; 14:陰性對照(超純水)。M: DNA ladder marker; 1～13: Different geographical populations, same as in table 1; 14: Negative control (ultra-pure water).

2.2 西花薊馬COⅠ基因序列變異分析

對西花薊馬不同地理種群共計(jì)175條COⅠ基因序列進(jìn)行變異分析(表2)，共檢測到596個(gè)保守位點(diǎn)，35個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)占序列總長的5.55%，其中含有12個(gè)自裔位點(diǎn)，23個(gè)簡約信息位點(diǎn)。自裔位點(diǎn)分別位于第22、41、93、101、102、125、126、414、444、565、567和585位；簡約信息位點(diǎn)分別位于第84、111、183、213、255、270、294、357、366、378、385、399、411、447、499、504、531、543、558、588、598、606和612位。所有序列的堿基平均含量分別為，A:31.1%,T:38.1%,C:14.5%,G:16.3%，A+T：69.2%。所有序列的總突變數(shù)(total number of mutations,η)為70，其中發(fā)生轉(zhuǎn)換的位點(diǎn)數(shù)為57，發(fā)生顛換的位點(diǎn)數(shù)為13，轉(zhuǎn)換/顛換偏倚率為4.093(表2)。

2.3 單倍型分布及遺傳多樣性分析

在所檢測的西花薊馬13個(gè)地理種群175條序列中，共檢測到13種單倍型(haplotype, H)(H1～H13)。其中，H2為優(yōu)勢共享單倍型，在13個(gè)種群中均有分布，共享序列共計(jì)80條，占序列總數(shù)的45.7%；其次為單倍型H3，除河北石家莊SJZ和山東青島QD種群外，在其他11個(gè)種群中均有分布，占序列總數(shù)的30.3%；此外，河北石家莊SJZ、黑龍江哈爾濱HEB和寧夏銀川YC，共享單倍型H4，所占比例為8.6%；山西太原TY、山東青島QD和云南昆明KM，共享單倍型H6，所占比例為5.7%；另有9種單倍型，即H1,H5,H7,H8,H9,H10,H11,H12和H13，分別為北京豐臺(tái)FT、河北石家莊SJZ、吉林四平SP、黑龍江哈爾濱HEB、山東青島QD(H9,H10)、河南洛陽LY、甘肅蘭州LZ和寧夏銀川YC等種群所特有(表3)。

表2 不同地理種群西花薊馬的mtDNA COⅠ基因序列變異分析Table 2 Results of mtDNA COⅠ gene sequences of F.occidentalis from different geographical populations

對單倍型多樣性Hd和核苷酸多樣性π進(jìn)行分析，結(jié)果表明，總體單倍型多樣性Hd0.691，不同地

理種群單倍型多樣性范圍0.425～0.732，單倍型多樣性最高和最低的種群分別為黑龍江哈爾濱HEB(Hd=0.732)和甘肅蘭州LZ(Hd=0.425)；總體核苷酸多樣性π0.00652，不同地理種群核苷酸多樣性范圍0.00070～0.01594，核苷酸多樣度最高和最低的種群分別為寧夏銀川YC(π=0.01594)和云南昆明KM(π=0.00070)。對各種群單倍型多樣性Hd和核苷酸多樣性π進(jìn)行綜合分析，結(jié)果表明各種群在地域上存在明顯的種群多樣性差異，其中，寧夏銀川YC(Hd=0.689,π=0.01594)和黑龍江哈爾濱HEB種群(Hd=0.732,π=0.01506)具有較高的多態(tài)性，而內(nèi)蒙古包頭BT和陜西寶雞BJ種群(Hd=0.476,π=0.00075)的多態(tài)性較低(表4)。Tajima′s D中性進(jìn)化模型檢驗(yàn)結(jié)果顯示，除河北石家莊SJZ、黑龍江哈爾濱HEB和寧夏銀川YC 3個(gè)種群外，其他種群的Tajima′s D檢驗(yàn)結(jié)果均未達(dá)到顯著水平。該結(jié)果表明，除上述3個(gè)種群以外的其他種群的mtDNA COⅠ基因的進(jìn)化都遵循中性模型。

表3 各單倍型在不同地理種群西花薊馬中的分布Table 3 Haplotypes of mtDNA COⅠ gene in different geographical populations of F.occidentalis

FT:北京豐臺(tái); SJZ:石家莊; TY:太原; BT:包頭; SY:沈陽; SP:四平; HEB:哈爾濱; QD:青島; LY:洛陽; KM:昆明; BJ:寶雞; LZ:蘭州; YC:銀川。

FT: Fengtai, Beijing； SJZ: Shijiazhuang； TY: Taiyuan； BT: Baotou； SY: Shenyang； SP: Siping； HEB: Harbin； QD: Qingdao； LY: Luoyang； KM: Kunming； BJ: Baoji； LZ: Lanzhou； YC:Yinchuan.

2.4 遺傳分化及基因流分析

將所有種群作為一個(gè)整體進(jìn)行分析，其總體固定系數(shù)Fst0.24359，變異范圍-0.05604～0.55271。總體基因流Nm0.78，變異范圍-40.04～35.75(表5)。綜合分析顯示，我國西花薊馬各地理種群之間可能已發(fā)生一定的分化。其中，黑龍江哈爾濱HEB種群與北京豐臺(tái)FT、山西太原TY、內(nèi)蒙古包頭BT、遼寧沈陽SY、吉林四平SP、山東青島QD、河南洛陽LY、云南昆明KM、陜西寶雞BJ和甘肅蘭州LZ等10個(gè)種群之間可能存在明顯分化；寧夏銀川YC種群與北京豐臺(tái)FT、山西太原TY、內(nèi)蒙古包頭BT、遼寧沈陽SY、吉林四平SP、山東青島QD、河南洛陽LY、云南昆明KM、陜西寶雞BJ和甘肅蘭州LZ等10個(gè)種群之間可能存在明顯分化；北京豐臺(tái)FT種群與山西太原TY、黑龍江哈爾濱HEB、山東青島QD、云南昆明KM、陜西寶雞BJ、甘肅蘭州LZ和寧夏銀川YC等7個(gè)種群之間可能存在明顯分化，與河北石家莊SJZ種群之間存在中度分化；山東青島QD種群與北京豐臺(tái)FT、內(nèi)蒙古包頭BT、遼寧沈陽SY、吉林四平SP、黑龍江哈爾濱HEB、河南洛陽LY和寧夏銀川YC等7個(gè)種群之間可能存在明顯分化，與陜西寶雞BJ、云南昆明KM和甘肅蘭州LZ等3個(gè)種群之間可能發(fā)生了中度分化(表5)。

表4 西花薊馬不同地理種群COⅠ基因單倍型、核苷酸多樣性分析及中性檢驗(yàn)Table 4 Haplotype diversity, nucleotide diversity and Tajima′s D neutrality test of F.occidentalis from different geographic populations

**P<0.01. FT:北京豐臺(tái); SJZ:石家莊; TY:太原; BT:包頭; SY:沈陽; SP:四平; HEB:哈爾濱; QD:青島; LY:洛陽; KM:昆明; BJ:寶雞; LZ:蘭州; YC:銀川。

**P<0.01. FT: Fengtai, Beijing； SJZ: Shijiazhuang； TY: Taiyuan； BT: Baotou； SY: Shenyang； SP: Siping； HEB: Harbin； QD: Qingdao； LY: Luoyang； KM: Kunming； BJ: Baoji； LZ: Lanzhou； YC: Yinchuan.

表5 西花薊馬種群間固定指數(shù)Fst (下三角形)和基因流Nm (上三角形)Table 5 Genetic fixation index (Fst) (lower triangular) and gene flow (Nm) (upper triangular) between geographical populations of F.occidentalis

FT:北京豐臺(tái); SJZ:石家莊; TY:太原; BT:包頭; SY:沈陽; SP:四平; HEB:哈爾濱; QD:青島; LY:洛陽; KM:昆明; BJ:寶雞; LZ:蘭州; YC:銀川。

FT: Fengtai, Beijing； SJZ: Shijiazhuang； TY: Taiyuan； BT: Baotou； SY: Shenyang； SP: Siping； HEB: Harbin； QD: Qingdao； LY: Luoyang； KM: Kunming； BJ: Baoji； LZ: Lanzhou； YC: Yinchuan.

2.5 AMOVA分子變異分析

AMOVA分析結(jié)果顯示，不同種群間的變異占總體變異的12.4%，同一種群內(nèi)不同個(gè)體間變異占87.6%，表明引起種群總體變異的主要因素為種群內(nèi)個(gè)體間的變異(表6)。

表6 西花薊馬各地理種群 mtDNA COⅠ 基因序列間的分子變異分析Table 6 Analysis of molecular variance among different geographical populations of F.occidentalis

2.6 西花薊馬各地理種群的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.6.1 基于本研究的西花薊馬13個(gè)地理種群的系統(tǒng)進(jìn)化分析 采用鄰接法構(gòu)建我國西花薊馬各地理種群不同單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹，并對系統(tǒng)發(fā)育樹顯示的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，13個(gè)單倍型并沒有按照地理分布形成明顯的分支格局，各單倍型分散在不同的地理種群中，沒有形成明顯的、系統(tǒng)的地理種群結(jié)構(gòu)(圖2)。整體顯示，系統(tǒng)發(fā)育樹分為明顯的兩大支。第一支：共享單倍型H2的地理種群和共享單倍型H5的地理種群聚在一起，13個(gè)地理種群都共享單倍型H2，其中河北石家莊SJZ種群還共享單倍型H5。此外，共享單倍型H1、H3、H7、H11和H12的地理種群聚在一起；其中，內(nèi)蒙古包頭BT、吉林四平SP、云南昆明KM、山西太原TY、寧夏銀川YC、河南洛陽LY、北京豐臺(tái)FT、甘肅蘭州LZ、遼寧沈陽SY、陜西寶雞BJ和黑龍江哈爾濱HEB等11個(gè)種群共享單倍型H3，北京豐臺(tái)FT種群共享單倍型H1，吉林四平SP種群共享單倍型H7，河南洛陽LY種群共享單倍型H11，甘肅蘭州LZ種群共享單倍型H12。同時(shí)，共享單倍型H6、H9、H10的地理種群聚在一起；其中，山東青島QD、山西太原TY和云南昆明KM等種群共享單倍型H6，且山東青島QD種群還共享單倍型H9和H10(圖2)。第二支：共享單倍型H4、H8、H13的地理種群聚在一起，其中河北石家莊SJZ、寧夏銀川YC和黑龍江哈爾濱HEB等3個(gè)種群共享單倍型H4，黑龍江哈爾濱HEB種群還共享單倍型H8，寧夏銀川YC種群共享單倍型H13(圖2)。

2.6.2 結(jié)合數(shù)據(jù)庫中已公開的西花薊馬不同地理種群的系統(tǒng)進(jìn)化分析 基于本研究已獲得的我國西花薊馬各地理種群不同單倍型COⅠ基因序列，結(jié)合GenBank中已公開的國內(nèi)外不同地理種群西花薊馬的高質(zhì)量COⅠ基因序列(片段大小為433～680 bp)(表7)[GenBank中已公開的西花薊馬序列多為廣泛存在的溫室品系序列，只有新西蘭的6條序列(EF555794～EF555799)為羽扇豆品系序列](Rugman-Jonesetal., 2010)，共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；同時(shí)，進(jìn)行單倍型(表7)和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。結(jié)果顯示，系統(tǒng)發(fā)育樹分成了明顯的兩大支(圖3)。

第一大支，包括4個(gè)分支。其中，第一分支：山西太原TY(H2,n=4)、甘肅蘭州LZ(H2,n=12)、吉林四平SP(H2,n=1)、山東青島QD(H2,n=14;H9,n=6)、北京豐臺(tái)FT(H2,n=4)、河南洛陽LY(H2,n=4)、黑龍江哈爾濱HEB(H2,n=6)、寧夏銀川YC(H2,n=8)、云南昆明KM(H2,n=12)、陜西寶雞BJ(H2,n=5)、遼寧沈陽SY(H2,n=2)、內(nèi)蒙古包頭BT(H2,n=2)和河北石家莊SJZ(H2,n=6;H5,n=1)等13個(gè)種群與GenBank中的北京Beijing(Beijing-2,n=3)和云南Yunnan(Yunnan-2,n=4;Yunnan-3,n=7)種群，以及國外的荷蘭Holland(Holland-5,n=3;Holland-3,n=8;Holland-6,n=3)、澳大利亞Australia(Australia-2,n=9)、美國加利福尼亞California(California-3,n=6)和堪薩斯Kansas(Kansas-2,n=6;Kansas-1,n=2)、新西蘭New Zealand(New Zealand-4,n=5)和日本Japan(Japan-1,n=7)等種群聚在一起(圖3)。第二分支：吉林四平SP(H3,n=3;H7,n=1)、黑龍江哈爾濱HEB(H3,n=7)、內(nèi)蒙古包頭BT(H3,n=5)、陜西寶雞BJ(H3,n=2)、山西太原TY(H3,n=2)、河南洛陽LY(H3,n=3;H11,n=1)、甘肅蘭州LZ(H3,n=3;H12,n=1)、北京豐臺(tái)FT(H3,n=13;H1,n=3)、遼寧沈陽SY(H3,n=3)、寧夏銀川YC(H3,n=3)和云南昆明KM(H3,n=9)等11個(gè)種群與GenBank中的北京Beijing(Beijing-4,n=4)和云南Yunnan種群(Yunnan-4,n=7)，以及國外的荷蘭Holland(Holland-2,n=1)、澳大利亞Australia(Australia-1,n=1)、美國加利福尼亞California(California-1,n=2)和肯尼亞Kenya(Kenya-1,n=1)等種群聚在一起(圖3)。第三分支：寧夏銀川YC(H4,n=1;H13,n=1)、黑龍江哈爾濱HEB(H4,n=8;H8,n=1)、河北石家莊SJZ(H4,n=1)等種群與GenBank中的北京Beijing(Beijing-1,n=1)和云南Yunnan(Yunnan-1,n=1)種群，以及國外的新西蘭New Zealand(New Zealand-2,n=1;New Zealand-3,n=5)和荷蘭Holland(Holland-4,n=1)等種群聚在一起(圖3)。第四分支：山東青島QD(H6,n=5;H10,n=2)、云南昆明KM(H6,n=4)和山西太原TY(H6,n=1)等種群與GenBank中的北京Beijing種群(Beijing-3,n=3)，以及國外的新西蘭New Zealand(New Zealand-1,n=1)、荷蘭Holland(Holland-1,n=1)、美國的加利福尼亞California(California-2,n=4)和紐約New York(New York-1,n=1;New York-2,n=2)及英國UK(UK-1,n=1)等種群聚在一起(圖3)。

圖2 鄰接法構(gòu)建的我國西花薊馬各地理種群不同單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbor-joining tree based on the analysis of the 13 haplotypes of F.occidentalis from different geographical populations in China分支處上方數(shù)值表示重復(fù)1000次后的自展值 (>50%)； 標(biāo)尺示遺傳距離。BT:內(nèi)蒙古包頭； SP:吉林四平； KM:云南昆明； TY:山西太原； LY:河南洛陽； YC:寧夏銀川； LZ:甘肅蘭州； BJ:陜西寶雞； HEB:黑龍江哈爾濱； SY:遼寧沈陽； QD:山東青島； FT:北京豐臺(tái)； SJZ:河北石家莊。Numbers on branches are bootstraped values (>50%) under 1000 replicates， the scale bar represents genetic distance.BT: Baotou, Neimenggu; SP: Siping, Jilin; KM: Kunming, Yunnan; TY: Taiyuan, Shanxi; LY: Luoyang, Henan; YC: Yinchuan, Ningxia; LZ: Lanzhou, Gansu; BJ: Baoji, Shaanxi; HEB: Harbin, Heilongjiang; SY: Shenyang, Liaoning; QD: Qingdao, Shandong; FT: Fengtai, Beijing; SJZ: Shijiazhuang, Hebei.

第二大支，南非South Africa(South Africa-1,n=1;South Africa-2,n=2)和意大利Italy種群(Italy-1,n=1;Italy-2,n=1)聚在一起，但未包含本研究的任一種群(圖3)。

在國外的所有序列中，只有單倍型編號(hào)為New Zealand-2(GenBank登錄號(hào)：EF555799)和New Zealand-3(GenBank登錄號(hào)：EF555794～EF555798)的序列為新西蘭西花薊馬的羽扇豆品系序列(Rugman-Jonesetal., 2010)，其余為廣泛分布的溫室品系序列。聚類分析還顯示，寧夏銀川YC種群的2條序列(H4,n=1;H13,n=1)、黑龍江哈爾濱HEB種群的9條序列(H4,n=8;H8,n=1)、河北石家莊SJZ種群的1條序列(H4,n=1)以及GenBank中北京Beijing種群的1條序列(Beijing-1,n=1)和云南Yunnan種群的1條序列(Yunnan-1,n=1)，與新西蘭西花薊馬的羽扇豆品系序列(GenBank登錄號(hào)：EF555794～EF555799)聚在一起，表明我國的北京、云南以及寧夏銀川、黑龍江哈爾濱、河北石家莊等部分地區(qū)已存在一定數(shù)量的西花薊馬羽扇豆品系。此外，荷蘭的1條序列(Holland-4,n=1)也與新西蘭的羽扇豆品系序列聚在一起，表明荷蘭亦存在西花薊馬的羽扇豆品系(圖3)。本研究中13個(gè)地理種群的其余序列，均為溫室品系序列，其可能的入侵來源推測如下：河北石家莊SJZ種群的序列與荷蘭、澳大利亞、美國加利福尼亞、美國堪薩斯、新西蘭、日本等種群的序列聚在一起，推測該種群可能來源于上述6個(gè)國家或地區(qū)(圖4A)；北京豐臺(tái)FT、河南洛陽LY、黑龍江哈爾濱HEB、遼寧沈陽SY、吉林四平SP、寧夏銀川YC、陜西寶雞BJ、內(nèi)蒙古包頭BT、山西太原TY、甘肅蘭州LZ等10個(gè)種群的序列與荷蘭、澳大利亞、美國加利福尼亞、美國堪薩斯、新西蘭、日本、肯尼亞等種群的序列聚在一起，推測我國上述10個(gè)區(qū)域的西花薊馬可能來源于這7個(gè)國家或地區(qū)(圖4B)；山東青島QD種群的序列與荷蘭、澳大利亞、美國加利福尼亞、美國堪薩斯、新西蘭、日本、美國紐約、英國等種群的序列聚在一起，推測該種群可能來源于上述這8個(gè)國家或地區(qū)(圖4C)；云南昆明KM種群的序列與荷蘭、澳大利亞、美國加利福尼亞、美國堪薩斯、新西蘭、日本、肯尼亞、美國紐約、英國等種群的序列聚在一起，推測該種群可能來源于上述這9個(gè)國家或地區(qū)(圖4D)。此結(jié)果說明，我國西花薊馬溫室品系的各地理種群存在多個(gè)入侵來源。

表7 NCBI數(shù)據(jù)庫中西花薊馬不同地理種群高質(zhì)量COⅠ基因序列登錄號(hào)Table 7 Accession numbers of partial COⅠ gene sequences of different geographical populations of F.occidentalis from GenBank

圖3 鄰接法構(gòu)建的西花薊馬不同地理種群COⅠ基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Neighbor-joining tree based on analysis of COⅠ gene sequences of F.occidentalis from different geographical populations分支處上方數(shù)值表示重復(fù)1000次后的自展值(>50%)； 標(biāo)尺示遺傳距離。BT:內(nèi)蒙古包頭； SP:吉林四平； KM:云南昆明； TY:山西太原； LY:河南洛陽； YC:寧夏銀川； LZ:甘肅蘭州； BJ:陜西寶雞； HEB:黑龍江哈爾濱； SY:遼寧沈陽； QD:山東青島； FT:北京豐臺(tái)； SJZ:河北石家莊； Beijing:北京; Yunnan:云南; New Zealand:新西蘭; Australia:澳大利亞; Japan:日本; Holland:荷蘭; South Africa:南非; Italy:意大利; Kenya:肯尼亞; UK:英國; California:加利福尼亞; Kansas:堪薩斯; New York:紐約。 Numbers on branches are bootstraped values (>50%) under 1000 replicates, the scale bar represents genetic distance.BT: Baotou, Neimenggu; SP: Siping, Jilin; KM: Kunming, Yunnan; TY: Taiyuan, Shanxi; LY: Luoyang, Henan; YC: Yinchuan, Ningxia; LZ: Lanzhou, Gansu; BJ: Baoji, Shaanxi; HEB: Harbin, Heilongjiang; SY: Shenyang, Liaoning; QD: Qingdao, Shandong; FT: Fengtai, Beijing; SJZ: Shijiazhuang, Hebei.

3 小結(jié)與討論

本研究利用mtDNA COⅠ基因序列分析我國西花薊馬的種群多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，并以此推測西花薊馬的來源和傳播擴(kuò)散途徑。研究涉及我國西花薊馬13個(gè)地理種群。研究結(jié)果顯示，無論是西花薊馬種群的覆蓋度還是每一種群的樣本數(shù)量，均符合研究物種種群遺傳關(guān)系分析的基本需求(Zhangetal., 2010)。

對西花薊馬13個(gè)地理種群共計(jì)175條COⅠ基因堿基序列進(jìn)行變異分析，共檢測到596個(gè)保守位點(diǎn)，35個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中自裔位點(diǎn)12個(gè)，簡約信息位點(diǎn)23個(gè)。所有序列中A+T含量為69.2%，表現(xiàn)出明顯的A/T堿基偏向性，與昆蟲線粒體基因組的堿基組成特征基本一致(Simonetal., 1994)。Kinght & Mindell(1993)研究指出，轉(zhuǎn)換/顛換偏倚率的臨界值為2，當(dāng)小于2時(shí)表明基因突變已達(dá)到飽和狀態(tài)，大于2時(shí)表明基因突變尚未達(dá)到飽和狀態(tài)。本研究中13個(gè)西花薊馬地理種群所有序列的總突變數(shù)η為70，發(fā)生轉(zhuǎn)換和顛換的位點(diǎn)數(shù)分別為57和13，轉(zhuǎn)換/顛換偏倚率為4.093，說明我國西花薊馬COⅠ基因堿基序列的突變尚未達(dá)到飽和狀態(tài)。

圖4 西花薊馬河北石家莊SJZ (A)、北京豐臺(tái)FT、河南洛陽LY、黑龍江哈爾濱HEB、遼寧沈陽SY、吉林四平SP、寧夏銀川YC、陜西寶雞BJ、內(nèi)蒙古包頭BT、山西太原TY、甘肅蘭州LZ (B)、山東青島QD (C)和云南昆明KM (D)等種群入侵來源地示意圖Fig.4 Diagram showing the sources of F.occidentalis of Shijiazhuang, Hebei (A), Fengtai, Beijing; Luoyang, Henan; Harbin, Heilongjiang; Shenyang, Liaoning; Siping, Jilin; Yinchuan, Ningxia; Baoji, Shaanxi; Baotou, Neimenggu; Taiyuan, Shanxi; and Lanzhou, Gansu (B), Qingdao, Shandong (C) and Kunming, Yunnan (D) populations綠色圓圈表示河北石家莊SJZ種群; CA:加利福尼亞； KS:堪薩斯； NY:紐約； UK:英國； NL:荷蘭； KE:肯尼亞； JP:日本； AU:澳大利亞； NZ: 新西蘭。Green circle indicates population Shijiazhuang, Hebei； CA: California; KS: Kansas; NY: New York; UK: United Kingdom; NL: Holland; KE: Kenya; JP: Japan; AU: Australia; NZ: New Zealand.

單倍型多樣性Hd和核苷酸多樣性π是衡量一個(gè)種群線粒體DNA遺傳多樣性的2個(gè)重要指標(biāo)。本研究對13個(gè)西花薊馬地理種群、175條COⅠ基因序列的單倍型多樣性和核苷酸多樣性的檢測結(jié)果顯示，13個(gè)地理種群共有13種單倍型。進(jìn)一步的綜合分析顯示，其總體單倍型多樣性較高，為0.691；但核苷酸多態(tài)性較低，僅為0.00652。其中，黑龍江哈爾濱HEB、寧夏銀川YC、云南昆明KM、山東青島QD、河南洛陽LY、山西太原TY、遼寧沈陽SY等種群均表現(xiàn)出較低的單倍型多樣性；而核苷酸多樣性較高的種群只有黑龍江哈爾濱HEB和寧夏銀川YC種群，從而可能會(huì)使這2個(gè)種群與我國目前發(fā)現(xiàn)的83%以上的種群發(fā)生遺傳分化。因此，我國西花薊馬可能是由一較小的有效種群迅速增長而來，雖然通過變異積累了一定的單倍型多樣性，但卻尚未積累足夠的核苷酸序列多樣性(Avise, 1998)。

固定指數(shù)Fst和基因流Nm是衡量種群遺傳分化的重要指標(biāo)。本研究對西花薊馬13個(gè)地理種群總體以及各種群之間的固定指數(shù)Fst和基因流Nm的分析結(jié)果顯示，各地理種群間可能存在一定程度的分化，其中黑龍江哈爾濱HEB、寧夏銀川YC、北京豐臺(tái)FT、山東青島QD等種群與其他種群之間可能出現(xiàn)了明顯分化。而不同種群間出現(xiàn)遺傳分化的原因，一方面可能是由于不同的地理分布區(qū)域，其溫度、濕度、寄主植物等環(huán)境因素不同，進(jìn)而導(dǎo)致西花薊馬在適應(yīng)不同的環(huán)境條件過程中可能出現(xiàn)一定的遺傳分化；另一方面可能與西花薊馬的入侵來源地不同有關(guān)；而后者所起作用可能更為重要。

武曉云等(2009)以COⅠ基因通用型引物mtD-7.2F/mtD-9.2R擴(kuò)增北京、云南昆明、黑龍江哈爾濱等三地，共計(jì)29頭西花薊馬的COⅠ基因片段(長度為433 bp，包含在本研究的650 bp靶標(biāo)序列之中，對齊位置約從200 bp開始)，通過聚類分析顯示，上述三地的部分COⅠ基因序列與數(shù)據(jù)庫中已公開的新西蘭西花薊馬的羽扇豆品系序列(EF555794～EF555799)聚在一起，表明上述三地的種群都存在一定數(shù)量的羽扇豆品系，其來源地可能是新西蘭。本研究以我國西花薊馬不同地理種群單倍型序列和國外不同地理種群單倍型序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，聚類分析結(jié)果顯示，我國西花薊馬亦存在2個(gè)品系，即羽扇豆品系和溫室品系。我國的北京豐臺(tái)、云南昆明、寧夏銀川、黑龍江哈爾濱、河北石家莊種群中已存在一定數(shù)量的羽扇豆品系，上述區(qū)域的部分西花薊馬可能來源于新西蘭或荷蘭。而廣泛存在于我國的不同地理種群的西花薊馬溫室品系存在多個(gè)入侵來源地。

隨著國際貿(mào)易以及國內(nèi)地區(qū)之間水果、蔬菜、花卉及其種苗的調(diào)運(yùn)或展覽展示，可能導(dǎo)致同一地理種群的西花薊馬存在多個(gè)入侵來源，或同一來源的多次入侵，或多個(gè)來源的多次入侵。該研究結(jié)果對西花薊馬的有效阻截及其種群擴(kuò)張趨勢監(jiān)測意義重大。

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