沙門氏菌檢測方法的研究進展

郭立明 張雪 厲華明

(1.日照市疾控中心 山東日照 276826;2.日照市第三中學(xué) 山東日照 276812;3.日照市衛(wèi)生學(xué)校 山東日照 276826)

沙門氏菌是一種常見的人獸共患病原菌,不僅會引起各種動物疾病,而且與人類多種疾病有關(guān),其中由沙門氏菌引起的食物中毒顯得尤為突出。根據(jù)世界衛(wèi)生組織報告, 1985年以來,在世界范圍內(nèi),由沙門氏菌引起的已確診的患病人數(shù)不斷增加,在一些歐洲國家已增加五倍以上。而在我國,由沙門氏菌引起的食物中毒屢居首位。據(jù)資料統(tǒng)計,在我國細(xì)菌性食物中毒中,70%～80%是由沙門氏菌引起,而在引起沙門氏菌中毒的食品中,90%以上是肉類等動物性產(chǎn)品。這不僅造成了巨大經(jīng)濟損失,而且嚴(yán)重威脅著人們的身體健康和生命安全,這使得沙門沙門氏菌的研究和預(yù)防顯得極為重要,而沙門氏菌的檢測方法正式這項工作開展的重點。筆者參考了國內(nèi)外文獻,認(rèn)為沙門氏菌研究方法主要包括三個方面:傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)檢測法、免疫學(xué)法和分子生物學(xué)法。傳統(tǒng)方法是一種國標(biāo)貨國際檢測的基本方法,但是它鑒定過程復(fù)雜,且耗時較長;免疫法是基于抗體的檢測方法,主要包括酶聯(lián)免疫吸附、斑點酶聯(lián)免疫吸附、免疫熒光標(biāo)記等,它不僅將檢測時間縮短了一半,且靈敏性高和特異性強;分子生物學(xué)法主要是以核酸為基礎(chǔ)的PCR技術(shù),由于靈敏、簡單、快速和特異已被廣泛用于沙門氏菌檢測。

1 傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)檢測方法

傳統(tǒng)方法是國標(biāo)法或國際法的一種基本方法,它方法簡單、準(zhǔn)確、可重復(fù)性強、有一定的靈敏性,最終能夠分離到細(xì)菌純培養(yǎng)物,因而也常常作為其他檢驗方法的準(zhǔn)確性、敏感性的參照。傳統(tǒng)方法檢測主要包括五個步驟:前增菌和增菌;分離純培養(yǎng)物;屬和種的鑒定;血清學(xué)分型;菌型的判定和結(jié)果報告。雖然方法簡單,但是過程復(fù)雜,且耗時長,全過程需要5個小時左右才能得出明確的診斷結(jié)果。

2 免疫學(xué)方法

免疫學(xué)方法基本原理是抗原和抗體的特異性結(jié)合。首先用分子標(biāo)記已知的抗體或抗原,其次使得標(biāo)記抗原或抗體與檢測物反應(yīng),通過標(biāo)記物來觀察是否存在抗原抗體特異性免疫反應(yīng),從而判斷出微量沙門氏菌的存在與否。該法不僅將檢測時間縮短了一半,而且具有很高的靈敏性和特異性,主要包括酶聯(lián)免疫吸附、斑點酶聯(lián)免疫吸附、免疫熒光標(biāo)記。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附

酶聯(lián)免疫吸附基本原理是將抗原或抗體預(yù)先結(jié)合在某種固相載體表面,然后加入受檢樣品和酶標(biāo)抗原或抗體,使其與結(jié)合在固相載體上的抗原或抗體起反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物,經(jīng)洗滌去除反應(yīng)液中其他物質(zhì),加入酶反應(yīng)底物后,底物被固相載體上的酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物,最后通過定性或定量分析有色產(chǎn)物即可確定樣品中待測物質(zhì)含量。

2.2 斑點酶聯(lián)免疫吸附

Dot-ELISA是以纖維素膜作為固相載體的一種新型免疫檢測技術(shù),其原理與常規(guī)ELISA法相同,可用于抗原或抗體的定性或定量檢測。其與ELISA的不同之處在于:一是將固相載體以硝酸纖維素濾膜、確酸醋酸混合纖維素濾膜、重氮節(jié)氧甲基化紙等固相化基質(zhì)膜代替,用以吸附抗原或抗體;二是顯色底物的供氫體為不溶性,結(jié)果在基質(zhì)膜上出現(xiàn)有色斑點進行判定。該方法簡便、特異、快速、結(jié)果直觀,便于在基層推廣使用。

2.3 免疫熒光標(biāo)記

免疫熒光抗體技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素,制成熒光抗體,再用這種熒光抗體作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素,利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光(黃綠色或橘紅色),可以看見熒光所在的組織細(xì)胞,從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位,以及利用定量技術(shù)測定含量。

3 分子生物學(xué)方法

分子生物學(xué)方法發(fā)展迅猛,在沙門氏菌探測中也發(fā)揮著重要作用,主要包括:聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)、基因芯片技術(shù)、熒光定量PCR。

3.1 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)

PCR技術(shù)是一項體外酶促擴增DNA技術(shù),具有特異性強、敏感性高、操作簡便、快速高效等特點。目前,PCR技術(shù)是一種快速、簡便、特異、靈敏檢測沙門氏菌的方法。2005年,汪琦等以全脂奶粉、生牛肉和加工過的雞肉為試驗對象,人為添加沙門氏菌,利用PCR方法快速檢測食品中的沙門氏菌,檢測結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法系統(tǒng)檢測結(jié)果一致,檢出限為100CFU/25g,準(zhǔn)確性達100%。

3.2 基因芯片技術(shù)

基因芯片是固定有很多已知序列DNA探針的硅片或玻片。將經(jīng)過熒光標(biāo)記的樣品分子與基因芯片上的DNA探針進行雜交,通過檢測每個探針分子的熒光信號強度以得到樣品分子的數(shù)量和序列信息,從而檢測沙門氏菌是否存在。鑒于基因芯片表面的DNA探針從幾十到幾百萬個不等,因而可以一次性檢測多種沙門氏菌,并同時得到病原菌的耐藥性等情況。

3.3 熒光定量PCR

實時熒光定量PCR技術(shù)是廣泛應(yīng)用于快速檢測的現(xiàn)代方法之一,它不僅實現(xiàn)了對DNA的定量檢測,而且具有較高的敏感性、特異性、可靠性和時效性,且自動化程度高、無污染性,能夠同時完成多種樣品的擴增及定量,適宜于大批量樣品的檢測。

4 結(jié)語

經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展,如今沙門氏菌建立起了三大檢測體系:傳統(tǒng)檢測方法、免疫學(xué)檢測方法和分子生物學(xué)檢測方法。它們都具備各自的優(yōu)勢和不足,且優(yōu)劣彼此互補,從而形成了完整、有效的沙門氏菌檢測方法。與此同時,其優(yōu)劣互補特性也提醒著科學(xué)家們需要進一步改進,從而發(fā)展出一種操作更簡單、更可靠、更高效的檢測方法。

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[2]張華.動物性產(chǎn)品中沙門氏菌的危害及控制措施[J].中國動物保健,2004(6):8-10.

[3]馬呈珠.山東省286起沙門菌食物中毒分析[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2005,17(1):19-20.