蒽環(huán)類抗生素糖基化的研究進(jìn)展

劉芷瑜

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福建福州 350108)

目前,已發(fā)現(xiàn)2000余種的蒽環(huán)類抗生素,大多都具有抗腫瘤活性,然而能夠應(yīng)用于臨床治療卻不多,這些抗腫瘤藥物應(yīng)用時還伴有心臟毒性和耐藥性等副作用[1],而可用于臨床治療的新型天然蒽環(huán)類抗生素的篩選十分困難,因此對蒽環(huán)類抗生素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,以期獲得生物活性更好,抗藥性更低的新型抗生素藥物。糖基化是目前改造蒽環(huán)類化合物成藥的重要手段,催化糖基化反應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase)作用機(jī)制已逐漸被闡明。本文介紹了近年來糖基化的蒽環(huán)類抗生素,以具體事例介紹了糖基化的生物功能,對控制其糖基化的糖基轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因進(jìn)行了闡述,簡述了近年來蒽環(huán)類抗生素的糖基化方式。

1 蒽環(huán)類抗生素及其作用機(jī)制

蒽環(huán)類(Anthracycline)抗生素是由一個四環(huán)糖苷配基通過糖苷鍵與一個或多個糖基側(cè)鏈連接而成的一類糖苷類化合物[2](見圖1)?？蓮V泛用于治療各種癌癥,如乳腺癌、淋巴瘤、急性白血病、神經(jīng)細(xì)胞瘤和軟組織肉瘤等[3]。目前常見的蒽環(huán)類抗生素主要有道諾霉素(Daunorubicin)、阿霉素(Adriamycin)、諾加霉素(Aogalamycin)、表柔比星(Epirubicin)、阿柔比星(Aclacinomycin)、洋紅霉素(Carminomycin)、吡柔比星(Pirarubicin)、米托蒽醌(Mitoxantrone)以及伊達(dá)比星(Idarubicin)等。

2 蒽環(huán)類抗生素糖基配體的生物功能

在蒽環(huán)類抗生素的芳香族聚酮體上通常具有一個或多個的脫氧己糖修飾,這些糖基不僅能增加化合物的溶解性,而且對識別作用靶點(diǎn)DNA序列也很重要,同時在一定程度上增強(qiáng)某些抗生素的化學(xué)穩(wěn)定性[4]。

蒽環(huán)類抗生素聚酮結(jié)構(gòu)的A環(huán)和糖基部分對DNA的識別及位點(diǎn)的選擇起著關(guān)鍵的作用。Lown等研究發(fā)現(xiàn)這類化合物與DNA的作用方式是蒽醌環(huán)嵌入DNA雙螺旋,蒽醌環(huán)的長軸基本垂直于堿基對的氫鍵,在DNA的小溝區(qū)存在氨基糖,大溝區(qū)有D環(huán)插入[5]。這樣的方式使堿基對之間的距離增加,引起DNA裂解。

諾加霉素是于1965年被發(fā)現(xiàn)由黑胡桃鏈霉菌(Streptomy cesnogalaterATCC27451)產(chǎn)生的重要的蒽環(huán)類抗生素[6],其生物活性需要兩個脫氧己糖:諾加糖胺(nogalamine)、諾加糖(nogalose),諾加霉素可與DNA發(fā)生交叉聯(lián)結(jié),部分?jǐn)嚅_DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)對多種腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)抑制活性和抗革蘭氏陽性菌作用[7]。在許多情況下,糖苷配基結(jié)構(gòu)的改變可以產(chǎn)生新的有活性的藥物[8]。表柔比星(epirubicin)是阿霉素的衍生物,通過在阿霉素的4-OH部位添加脫氧糖基團(tuán),使得這種衍生物比道諾霉素毒性更小[3],大大降低了心臟毒性而成為更理想的臨床抗腫瘤藥物。從加利利鏈霉菌(Strepto myces galilaeus)中提取的新蒽環(huán)抗生素阿柔比星X(見圖1b),經(jīng)IR吸收光譜顯示在其配糖體阿柔比星存在羥基、酯羰基。經(jīng)檢測,阿柔比星X有更為顯著的胞內(nèi)毒性[9]。越野他汀(kosinostatin,KST)是從海洋小單孢菌Micromonospora sp.TP-A0468中分離得到的一種具有良好抗腫瘤活性的蒽環(huán)類抗生素,異醌環(huán)素B與越野他汀是結(jié)構(gòu)類似物,對異醌環(huán)素B糖基的3＇＇位脫氧得到脫氧異醌環(huán)素B,李慧等人用人肺癌細(xì)胞h1299測試了二者的體外細(xì)胞毒性,發(fā)現(xiàn)脫氧異醌環(huán)素B比異醌環(huán)素B的活性降低1個數(shù)量級[10],這也體現(xiàn)了研究糖基化的天然產(chǎn)物的重要意義。

3 蒽環(huán)抗生素的糖基化

3.1 蒽環(huán)糖基轉(zhuǎn)移酶

糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase,GTase)通常負(fù)責(zé)將供體的糖單體部分轉(zhuǎn)移到特異的受體,從而形成特異的糖苷鍵[11]。這些特定的受體分子可以是核酸、蛋白質(zhì)、脂類、寡糖、各類雜環(huán)化合物及次級代謝產(chǎn)物。糖基供體包括核苷酸二磷酸活化形式(NDP-)的各種糖基,主要是一些NDP-己糖,其中UDP-葡萄糖最為常見;另外還包括一些NDP-脫氧己糖以及許多稀有的NDP-糖胺等[12]。

糖基轉(zhuǎn)移酶的機(jī)制:(1)GT-催化的反應(yīng)的可能的立體化學(xué)結(jié)果。(2)直接位移機(jī)制提出了反相GTs。(3)雙位移機(jī)制提出保留GTs。(4)替代機(jī)制來保留涉及由糖分子作為離去基團(tuán)出發(fā)的同一面上親核進(jìn)攻GTs。(5)提議為芳基-C-糖苷鍵的形成機(jī)制。(6)UrdGT2催化了C-和O-糖苷鍵的形成。大部分糖基轉(zhuǎn)移酶均有類似尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖和UDP-葡萄糖醛轉(zhuǎn)移酶中C端富含甘氨酸的保守區(qū)域[13]。Liu、Salas對糖基轉(zhuǎn)移酶的催化機(jī)制做了詳盡綜述[14]。

3.2 糖基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因

隨著對抗生素生物合成基因簇研究的不斷深入,目前已報(bào)道了50多個編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因[13]。通過插入失活的糖合成基因或敲除部分基因得到缺失了糖環(huán)的中間體或是糖苷配基上連接了結(jié)構(gòu)已改變的糖代謝中間體,以證明某些基因參與糖的生物合成。

許多糖基轉(zhuǎn)移酶基因的作用機(jī)制大體相似。例如,能夠編碼轉(zhuǎn)移氨基脫氧糖的糖基轉(zhuǎn)移酶基因,cosG[3](來自鏈霉菌中的cosmomycin),Dnrs(來自S.peucetius中的道諾霉素),AclS(來自S.galilaeus中的阿柔比星),RhoG(來自S.violaceus中的紫紅霉素)以及DesVII(來自S.venezuelaeZ中的苦霉素)。CosK與AknK相似(從S.galilaeus中提出的阿柔比星)都能在阿柔比星生物合成中添加2-脫氧-巖藻糖。

Sianidis等人從Streptomyces echinatus中克隆了一種編碼新型糖基轉(zhuǎn)移酶AraGT的基因araGT。AraGT能將甲基戊糖轉(zhuǎn)移至Aranciamycin糖苷配基上。AraGT的出現(xiàn)為擴(kuò)大Aranciamycin衍生物文庫有重要意義[4]。諾加霉素衍生物諾加霉素R和諾加霉素F,二者的形成都是由于諾加霉素的諾加糖被取代,諾加霉素的生物合成中有三個糖基轉(zhuǎn)移酶,其中SnogE和SnogD分別作為諾加糖和諾加糖胺的轉(zhuǎn)移酶。諾加糖胺轉(zhuǎn)移酶SnogD能夠從諾加霉素F中去除2—脫氧糖,而在snogZ簇中的糖基轉(zhuǎn)移酶作用不大[15]。若中斷snogE基因得突變株mSXW-2-71發(fā)酵產(chǎn)物中檢測不到諾加霉素的產(chǎn)生[16]。

有些糖基轉(zhuǎn)移酶具有一定的靈活的底物適應(yīng)性,可以識別多種糖基供體。例如,異醌環(huán)素B糖基的C-3''位脫氧產(chǎn)生的脫氧異醌環(huán)素B是越野他汀和異醌環(huán)素B的結(jié)構(gòu)類似物,其基因簇中的kstD5能夠編碼一個對糖基底物識別不專一的糖基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)越野他汀與異醌環(huán)素B分子中兩種不同糖基的識別和轉(zhuǎn)移[10]。Lu等報(bào)道了從S.galilaeus ATCC 31615中獲取的糖基轉(zhuǎn)移酶基因aknK。aknK編碼的AknKGT作用于蒽環(huán)類抗腫瘤藥物阿柔比星A的生物合成。AknK不僅能夠通過串聯(lián)L-2-脫氧巖藻糖來催化一系列三糖鏈,還可以接受其他單糖基化的蒽環(huán)類抗生素,包括道諾霉素、阿霉素、伊達(dá)比星等來建立蒽環(huán)類抗生素的二糖變體[17]。又如,埃洛霉素(Elloramycin)是從S.olivaceus Tu2353中提出的蒽環(huán)類抗生素類似物,其基因編碼的elmGT能夠轉(zhuǎn)移不同的單糖和二糖至糖苷配基8-demethyl-tetracenomycin C(8-DMTC)上。質(zhì)粒cos16F4包含編碼合成埃羅霉素中間體8-脫甲基丁省霉素C的生物合成基因簇以及elmGT基因,在竹桃霉素的生物合成基因簇中有合成L-鼠李糖、L-橄欖糖和L-夾竹桃糖的3種質(zhì)粒。將cos16F4與上述質(zhì)粒重組,在S.olivaceus中共同表達(dá)出三種新的混合抗生素。將cos16F4分別與合成NDP-Lmycarose、NDP-4-deacetyl-L-nogalose的質(zhì)粒pFL942、pFL947共同表達(dá)得到相應(yīng)糖苷化衍生物[18],這些都說明elmGT的寬的底物適應(yīng)性。許多酶都具有寬泛性,像將阿維菌素中的4-酮基還原酶AvrE或者紅霉素合成途徑中的EryBIV分別在Streptomyces peucetius所產(chǎn)的阿霉素(本身缺乏4-酮基還原酶合成基因)中表達(dá)都能得到表柔比星[19]。研究利用這些酶的特性為獲得更多蒽環(huán)類衍生物奠定了基礎(chǔ)。

其實(shí),大部分蒽環(huán)糖基轉(zhuǎn)移酶是單獨(dú)作用的,但是要在自然狀態(tài)下糖基化多種糖苷配基還需其他輔助蛋白的激活,例如阿柔比星A的生物合成過程中,AknSGT能將L-氨基脫氧糖轉(zhuǎn)移至阿柔比星A的糖苷配基上,而只有經(jīng)過輔助蛋白AknT的激活才能發(fā)揮糖基化功能[20]。若同時敲除光輝霉素的4個糖基轉(zhuǎn)移酶形成的突變株中不能合成得到雙糖衍生物,但有趣的是當(dāng)同時表達(dá)光輝霉素的兩個糖苷轉(zhuǎn)移酶(MemGⅠ、MemGⅡ)和ElmGT時能得到這個雙糖的衍生物,這是首次通過3個糖苷轉(zhuǎn)移酶共同作用產(chǎn)生新糖苷化衍生物,此衍生物的產(chǎn)生是運(yùn)用糖苷轉(zhuǎn)移酶的組合生物合成[21]。在大環(huán)內(nèi)酯類抗生素中也有類似情況,DesVII作用則需要一個輔助蛋DesVIII,EryCII作用需要輔助蛋白EryCIII的激活。

3.3 糖基化方式

糖基化通常發(fā)生在蒽環(huán)類抗生素生物合成的后期,利用糖基轉(zhuǎn)移酶使糖苷配基在C7-OH上被糖基化[17]。根據(jù)糖苷鍵類型不同,可分為O-糖基化、N-糖基化、C-糖基化。C-糖基化較為罕見,糖基供體和受體之間通過稀有的C-C糖苷鍵連接其生物學(xué)機(jī)制還未徹底闡明。目前含C-糖基化的抗生素有榴紅菌素(granaticin)、smiocyclinoneD8、美達(dá)霉素(medemycin)、gilvocarcin、hedamycin、烏達(dá)霉素(urdamycin)[22],而蒽環(huán)類抗生素的C-糖基化更為少見,諾加霉素的兩個脫氧糖:諾加糖胺(Nogalamine)、諾加糖(Nogalose),分別附加在芳香聚酮糖苷配基的C1和C7位,氨基諾加糖通過C-C鍵連接C2和C5＇＇,由此形成一個蒽環(huán)骨架C-C鍵縮合成并環(huán)的結(jié)構(gòu)[23](見圖2)。

目前,通過遺傳和生化方法進(jìn)行體內(nèi)糖基化已取得顯著進(jìn)展。例如,通過重塑糖生物合成工具以產(chǎn)生不同的糖結(jié)構(gòu),將外源的糖基轉(zhuǎn)移酶基因在適當(dāng)?shù)木曛挟愒幢磉_(dá)以促進(jìn)各種糖供體和受體之間耦合,又如通過化學(xué)方法將非天然的糖基轉(zhuǎn)移至天然產(chǎn)物中[4]。然而由于細(xì)胞生長或死亡都會抑制這種體內(nèi)糖基化,化學(xué)試劑又會影響復(fù)雜的糖基化系統(tǒng),尋找更合適的糖基化方式非常重要。

將分離的糖基轉(zhuǎn)移酶在體外進(jìn)行糖基化可以基本克服上述難題,例如利用體外酶法對天然產(chǎn)物糖基進(jìn)行側(cè)鏈改造[24]:通過體外制備不同種類NDP-糖并純化GTs,具有底物適應(yīng)性的GTs催化配糖體和不同NDP-糖基發(fā)生連接反應(yīng),從而對天然產(chǎn)物進(jìn)行糖基側(cè)鏈改造。通過易錯PCR、飽和突變、DNA重組等方式建立新糖基轉(zhuǎn)移酶基因的突變體庫,同時對不同突變基因表達(dá)的酶進(jìn)行篩選,這種體外定向獲取糖基轉(zhuǎn)移酶的方法不僅能提高酶的寬泛性,也能提高催化活性[25]。

李路等人報(bào)道了一種合成柔紅霉素糖基類似物的新方法利用Ferrier重排反應(yīng)使L-di-0-acetylrhamnal轉(zhuǎn)化成β,γ-不飽和內(nèi)酯,再經(jīng)Mi1sunobu反應(yīng),疊氮化反應(yīng),并利用TBDMSCI保護(hù)合成了兩種糖基供體,使用三氟甲磺酸三甲基硅酯催化糖基供體得到,這種方法簡單易行且收率較高[26]。肟鍵的構(gòu)建也已成為合成共軛糖肽的合理路線,將帶有1-ONH2的多種類型糖基與簡化的蒽醌母核以肟醚的形式連接,這樣既除去了C-4位甲氧基又降低了可導(dǎo)致心臟毒性的二級醇代謝產(chǎn)物的生成,從而得到毒性更小,抗癌活性更好的蒽環(huán)類抗生素[23]。

大多數(shù)天然抗生素去糖基化會導(dǎo)致生物活性降低甚至失活。例如,Westman EL.等人通過NADH脫氫酶讓阿霉素發(fā)生還原型去糖基化使Streptomyces WAC04685 所產(chǎn)阿霉素失活[27]。發(fā)生去糖基化除了可以運(yùn)用酶,物理化學(xué)法也有報(bào)道。屈海云等人運(yùn)用光譜電化學(xué)等技術(shù),使DRN(道諾霉素)稀溶液經(jīng)歷一可逆電極過程,結(jié)果證明這是一種典型的還原脫糖反應(yīng)。道諾霉素在電極上被還原之后緊接著發(fā)生一糖基脫除的化學(xué)反應(yīng)。在循環(huán)伏安體系中,道諾霉素的電極還原和脫糖反應(yīng)是一對競爭反應(yīng),當(dāng)掃速較大時,電極反應(yīng)的快速進(jìn)行抑制了化學(xué)脫糖反應(yīng)的發(fā)生,還原產(chǎn)物很快被重新氧化,但當(dāng)掃速較慢時,部分還原產(chǎn)物在未被重新氧化之前,發(fā)生了后續(xù)的脫糖反應(yīng)[28]。

4 結(jié)語

蒽環(huán)類抗生素作為化療領(lǐng)域重要的抗腫瘤藥物,雖有顯著的抗癌效果卻伴有嚴(yán)重的心臟毒性以及多重抗藥性,這無疑限制了其臨床應(yīng)用,經(jīng)糖基化的抗腫瘤藥物由于糖基的存在,能夠協(xié)助藥物生物轉(zhuǎn)運(yùn)并特異性識別、結(jié)合DNA。而開發(fā)具有底物靈活性的糖基轉(zhuǎn)移酶,能夠?qū)⑻腔D(zhuǎn)移至各種聚酮化合物。因此,它們可以作用于小型化合物庫以開發(fā)有價(jià)值的藥物[4]。通過糖基化方法重塑天然蒽環(huán)類抗生素的結(jié)構(gòu)對開發(fā)低毒的臨床候選藥物意義重大。

圖1 蒽環(huán)類抗生素

圖2 諾加霉素

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