蛋白質(zhì)組學(xué)在人乳及牛乳蛋白研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀*

楊梅，徐鑫，張居明，烏日娜，岳喜慶

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽，110866)

“蛋白質(zhì)組”是由澳大利亞學(xué)者Wilkins等于1994年提出，指的是由基因組編碼的全部蛋白質(zhì)［1］。根據(jù)乳蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容，可以分為結(jié)構(gòu)乳蛋白質(zhì)組學(xué)和功能乳蛋白質(zhì)組學(xué)。結(jié)構(gòu)乳蛋白質(zhì)組學(xué)主要是研究乳中蛋白質(zhì)的表達(dá)模式;功能乳蛋白質(zhì)組學(xué)主要是研究乳中蛋白質(zhì)的功能及蛋白質(zhì)間的相互作用［2］。乳蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法主要有兩種:一種是“全蛋白質(zhì)組學(xué)”，也就是檢測乳中基因組表達(dá)的所有蛋白質(zhì);另一種是“差異蛋白質(zhì)組學(xué)”，主要是篩選和鑒定不同種類或不同狀態(tài)下各樣本乳之間蛋白質(zhì)組的區(qū)別與變化［3］。

乳中的主要成分是由乳蛋白、乳糖和乳脂構(gòu)成，其中乳蛋白質(zhì)是乳中最重要的組成成分。乳蛋白質(zhì)可以為新兒和哺乳動(dòng)物提供氮、酶、激素及免疫物質(zhì)等，對(duì)其健康成長有重要的作用。乳中含有豐富的蛋白質(zhì)，其中酪蛋白(CN)、乳清蛋白(WP)和乳脂球膜蛋白(MFGM)是乳蛋白的重要組成部分［4-5］。乳中有種類多樣、含量豐富的蛋白質(zhì)，由于遺傳變異和翻譯后修飾對(duì)乳蛋白的影響，使乳蛋白的組成變得復(fù)雜、龐大［6］。本文闡述了蛋白質(zhì)組學(xué)在人乳與牛乳蛋白研究中的應(yīng)用進(jìn)展，以及乳酪蛋白質(zhì)組學(xué)、乳清蛋白質(zhì)組學(xué)、乳脂肪球膜蛋白質(zhì)組學(xué)、乳鐵蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，為尋找疾病的臨床診斷和治療、乳品加工保存條件、開發(fā)新型嬰幼兒食品提供重要的理論依據(jù)。

1 乳蛋白

乳蛋白質(zhì)是乳中最重要的組成成分之一，其含量和組成是決定乳質(zhì)量的重要指標(biāo)。乳中的蛋白質(zhì)調(diào)控著嬰幼兒及哺乳動(dòng)物幼崽的生命活動(dòng)。通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)乳蛋白進(jìn)行研究，能夠直觀、整體地分析蛋白質(zhì)的組成以及在生命活動(dòng)中的調(diào)控規(guī)律，可以更全面深入地闡明蛋白質(zhì)的表達(dá)信息。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以對(duì)乳中蛋白質(zhì)的含量以及組分進(jìn)行鑒定，也可對(duì)乳中蛋白的糖基化、磷酸化、乙?；确g后修飾進(jìn)行特征性描述，蛋白質(zhì)組學(xué)己成為乳蛋白表達(dá)和翻譯后修飾分析的重要工具［7］。因此，研究人乳與牛乳蛋白能夠?yàn)槿榈墓δ苄再|(zhì)、營養(yǎng)價(jià)值以及分泌機(jī)制提供有利的依據(jù)。

1.1 乳蛋白的遺傳多態(tài)性

乳蛋白是由乳腺上皮細(xì)胞合成并分泌的營養(yǎng)物質(zhì)，乳蛋白的基因型受位于常染色體上的等顯性基因控制，屬于孟德爾式遺傳。1953年，Aschaffenburg等利用紙層析法對(duì)牛乳中的β-乳球蛋白進(jìn)行首次分析，得到2種不同的遺傳變異體，由此展開了對(duì)乳蛋白多態(tài)性研究的序幕［8］。隨后，許多學(xué)者利用脲素-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Urea-APGE)和等電聚焦電泳(IEF)等先進(jìn)方法檢測不同蛋白變異體在乳中的分布情況，對(duì)乳蛋白多態(tài)性方面有了深入的了解。許多學(xué)者認(rèn)為，乳蛋白遺傳變異是基因直接表達(dá)的產(chǎn)物，其多態(tài)性的類型受到顯性基因控制，是基因產(chǎn)物直接表達(dá)的形式，并研究了乳清蛋白中2個(gè)蛋白的位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了11個(gè)復(fù)等位基因［9］。目前，還沒有對(duì)乳蛋白遺傳多態(tài)性進(jìn)行深入、系統(tǒng)的研究。因此，利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究乳蛋白遺傳多態(tài)性以及乳蛋白泌乳性能相關(guān)性，有助于對(duì)乳的遺傳多樣性、遺傳分化的了解。

1.2 乳蛋白的翻譯后修飾

人乳與牛乳中蛋白質(zhì)的正常功能是由體內(nèi)基因表達(dá)產(chǎn)物空間構(gòu)象的正確形成決定的，在此過程中蛋白質(zhì)的翻譯后修飾發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。由于翻譯后修飾使乳蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得更加復(fù)雜，調(diào)節(jié)更加精細(xì)，作用更加專一［10］。翻譯后修飾存在20種以上的修飾類型，比較常見的有糖基化、乙?；⒎核鼗?、磷酸化，目前對(duì)乳蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究較多的為糖基化和磷酸化。研究乳蛋白質(zhì)翻譯后修飾對(duì)了解乳蛋白的結(jié)構(gòu)和功能具有重要的意義。Holland等［11］采用2-DE與β-消除結(jié)合的方法從牛乳中分離出了κ-酪蛋白，并利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定出5個(gè)潛在的O-糖基化位點(diǎn)存在于 κ-酪蛋白中。Froehlich等［12］利用蛋白組學(xué)的方法對(duì)人乳中糖蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行研究，結(jié)果表明，乳鐵蛋白的糖基化程度在泌乳期的前期呈動(dòng)態(tài)變化，并且在一些乳清蛋白中也存在糖基化程度變化。Miclo等［13］利用2-DE技術(shù)分離了低分子質(zhì)量β-酪蛋白，并結(jié)合LC-ESI-MS技術(shù)鑒定出β-酪蛋白是由于磷酸化修飾從而形成了存在17個(gè)磷酸基團(tuán)的低分子質(zhì)量的磷酸化β-酪蛋白。對(duì)乳蛋白質(zhì)翻譯后修飾的深入研究，有利于預(yù)防和治療由其引起的疾病，以及為乳的功能性質(zhì)以及營養(yǎng)價(jià)值提供有利的依據(jù)。

1.3 乳高豐度蛋白分析

乳中的高豐度蛋白主要是由酪蛋白以及乳清蛋白構(gòu)成，利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)乳中高豐度蛋白的分析相對(duì)較為簡單。Aslam等［14］利用2-DE技術(shù)對(duì)奶牛哺乳期乳蛋白的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)隨著哺乳期的延長酪蛋白含量有所降低。Ferranti等［15］采用高效液相色譜(HPLC)的方法將CN進(jìn)行分離，得到了4個(gè)主要的峰，經(jīng)電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)鑒定，每個(gè)峰只含有1個(gè)酪蛋白家族，它們分別是αs1-CN、αs2-CN、β-CN 和 κ-CN。Miranda等［16］利用反向高效液相色譜(RP-HPLC)和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術(shù)對(duì)脫脂乳蛋白中的CN進(jìn)行分離，經(jīng)由Edman微序列和質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)了αs1-CN和β-CN存在多態(tài)性。對(duì)乳蛋白中的主要成分的鑒定，有利于更深入的了解物種間、品種間乳蛋白的差異，為乳產(chǎn)品提供更多的有利信息。

1.4 乳低豐度蛋白分析

乳蛋白中含有一部分含量很少卻可以作為調(diào)控蛋白、受體和酶等具有生物學(xué)特定功能的蛋白質(zhì)，也就是低豐度蛋白。利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)乳低豐度蛋白進(jìn)行分析時(shí)，需要移除高豐度蛋白，或者相對(duì)富集低豐度蛋白，是對(duì)乳低豐度蛋白研究的主要方法。Yamada等［17］通過免疫吸附的方法除去β-CN以及免疫球蛋白后，研究了奶牛初乳和常乳中低豐度差異蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)奶牛初乳中含有特異的蛋白質(zhì)。Holland等［18］利用半胱氨酸標(biāo)簽法移除了αs1-CN和β-CN這2種酪蛋白后，對(duì)乳清中其他類型酪蛋白異構(gòu)體進(jìn)行了分析。Panchaud等［19］利用陰離子交換和分子過濾作用的方法富集了人乳中的低豐度蛋白，接著通過SCX/RP進(jìn)行分離，利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定出乳清中43種蛋白質(zhì)。在對(duì)人初乳的研究中，通過免疫吸附去除高豐度蛋白質(zhì)后，鑒定出151個(gè)乳清蛋白質(zhì)，其中有83種是從前沒有發(fā)現(xiàn)的［20］。因此，乳中低豐度蛋白的檢測對(duì)全面認(rèn)識(shí)乳蛋白有重要意義。

1.5 乳蛋白質(zhì)水解分析

乳蛋白質(zhì)的水解主要為酶水解、化學(xué)水解和物理水解等。乳蛋白質(zhì)經(jīng)水解后獲得的多肽具有易于吸收利用，抗高血壓，促進(jìn)鈣、磷吸收，抗血栓等特定功能。因此，乳蛋白水解后獲得的小分子肽具有比蛋白質(zhì)更高的營養(yǎng)價(jià)值和生物活性。Kunji等［21］將蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)中存在編碼關(guān)鍵酶的幾個(gè)基因切除后，分析了L.lactis中β-酪蛋白的水解途徑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞壁上存在具有底物特異性的蛋白酶，并且在β-酪蛋白的C-末端表現(xiàn)。Rival等［22-23］利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)利用胰蛋白酶將β-酪蛋白酶解后多肽的抗氧化活性最強(qiáng)，將酶解后的多肽進(jìn)行分離純化，獲得了3個(gè)具有較強(qiáng)抗氧化活性的多肽段，并證實(shí)了β-酪蛋白酶解物具有抑制過氧化反應(yīng)的功能。Deutsch 等［24］對(duì) Lactobacillus helveticus、Lactobacillus delbruecki subsp.lactis和 Streptococcus thermophilus幾種嗜熱乳酸菌提取物的水解作用進(jìn)行了分析，其中L.helveticus對(duì)β-酪蛋白的水解能力最強(qiáng)，但水解產(chǎn)物中的磷酸肽幾乎是不能被降解的。因此，研究乳蛋白質(zhì)水解多肽有利于提高乳蛋白的利用價(jià)值，并為開發(fā)新的功能性食品提供依據(jù)。

2 乳蛋白質(zhì)組學(xué)

2.1 乳酪蛋白質(zhì)組學(xué)

乳酪蛋白是由乳腺上皮細(xì)胞合成的磷蛋白，含有大量的磷和鈣以及幾乎全部的必需氨基酸，是對(duì)新生兒及幼崽最具營養(yǎng)價(jià)值的蛋白質(zhì)，可以對(duì)鈣和磷的吸收具有促進(jìn)作用。CN通過新生兒或幼崽胃腸道蛋白酶作用后，釋放出的生物活性肽對(duì)新生兒或幼崽的消化、吸收和免疫具有調(diào)節(jié)作用。因此，利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究乳酪蛋白對(duì)了解乳蛋白對(duì)新生兒及幼崽的生命活動(dòng)有重要作用。Ciavardelli等［25］采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法的方法對(duì)牛乳中α-CN和β-CN磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行了鑒定，使CN的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)成為乳酪蛋白組學(xué)研究的重點(diǎn)。Poth等［26］采用2-DE結(jié)合MALDI-TOF-MS的方法分離并鑒定了人乳蛋白，對(duì)磷酸化程度進(jìn)行了分析，得到了6個(gè)磷酸化β-CN點(diǎn)。Girardet［27］等采用RP-HPLC分離技術(shù)得到了β-CN，并結(jié)合ESI-MS/MS鑒定出β-CN具有不同的磷酸化形式。Brophy等［28］采用IPG技術(shù)分析了正常牛乳和轉(zhuǎn)基因牛乳中的β-酪蛋白和κ-酪蛋白，并進(jìn)行了定量比較，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因牛乳中的酪蛋白比正常牛乳含量更高。Claverol［29］等采用了2-DE結(jié)合MS技術(shù)的方法對(duì)κ-酪蛋白的混合物進(jìn)行研究，并揭示了將不同的磷酸化和糖基化模式分離成的異構(gòu)體的方法。一些其他學(xué)者利用2-DE結(jié)合質(zhì)譜的方法對(duì)乳中的αs1-酪蛋白異構(gòu)體進(jìn)行了研究［30］。以及利用2-DE的方法分析了酪蛋白亞型模式［31］。利用2-DE的方法對(duì)水牛乳酪蛋白和牛乳酪蛋白進(jìn)行差異蛋白分析，通過電泳圖譜對(duì)比，發(fā)現(xiàn)了14個(gè)差異點(diǎn)，而在水牛乳酪蛋白與山羊乳酪蛋白的電泳圖譜中發(fā)現(xiàn)了10個(gè)差異蛋白點(diǎn)，利用質(zhì)譜進(jìn)行鑒定，得到了4個(gè)存在于水牛乳酪蛋白的主要組分，為在不同乳源蛋白中發(fā)現(xiàn)未知蛋白提供依據(jù)［32］。

2.2 乳清蛋白質(zhì)組學(xué)

乳清蛋白是乳去除CN后，分離出來的乳清中所含有的蛋白質(zhì)。乳清蛋白中存在較多對(duì)機(jī)體具有調(diào)控和免疫作用的免疫球蛋白。近年來，通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體防御蛋白質(zhì)作為含量最大的蛋白質(zhì)種類存在于乳清蛋白中，機(jī)體防御蛋白質(zhì)包括含量較高的免疫球蛋白以及含量較低的補(bǔ)體系統(tǒng)蛋白等［33］。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，乳清蛋白作為研究乳房炎的關(guān)鍵，通過對(duì)比患乳房炎及健康乳房分泌蛋白在種類及組成上的差異，找出能夠預(yù)測隱型乳房炎的生物標(biāo)記物，因此乳清蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為預(yù)測乳房炎的關(guān)鍵。Boehmer等［34］通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)受大腸桿菌侵染的乳房與侵染不同時(shí)間分泌的乳清蛋白質(zhì)的組成及含量進(jìn)行了差異分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抗菌肽-1蛋白和肽聚糖識(shí)別蛋白受體蛋白的含量隨著侵染時(shí)間及體細(xì)胞數(shù)的增加而增加。將牛乳乳清蛋白通過熱處理變性后，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定出β-乳球蛋白經(jīng)過水解能夠產(chǎn)生2種多肽，因此β-乳球蛋白能夠作為定量分析乳及乳制品中未降解乳清蛋白含量的目標(biāo)蛋白［35］。Murakami等［36］采用2-DE的方法對(duì)乳清中的蛋白質(zhì)組分進(jìn)行了分離，并且對(duì)蛋白質(zhì)的斑點(diǎn)進(jìn)行鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在51ku處的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)為凝聚素α-鏈。因此，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究乳清蛋白有利于對(duì)疾病的預(yù)防與治療。

2.3 乳脂肪球膜蛋白組學(xué)

近年來，乳脂球膜(MFGM)蛋白作為乳蛋白的一個(gè)特異性亞類受到許多學(xué)者的關(guān)注。乳脂肪球膜蛋白質(zhì)包含來自于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)，可以部分代表泌乳細(xì)胞中的蛋白質(zhì)［37-38］。Charlwood等［39］采用2-DE分離技術(shù)結(jié)合 MALDI-TOF鑒定的方法，研究了人乳脂球膜蛋白中凝聚素、乳轉(zhuǎn)鐵蛋白、多聚免疫球蛋白受體和lactadherin 4個(gè)主要蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)這4種蛋白的糖基序范圍差異較大。Goldfarb等［40］采用2-DE的方法對(duì)人乳脂球膜蛋白進(jìn)行了分離與鑒定，發(fā)現(xiàn)阿樸脂蛋白E存在4種分子質(zhì)量的異構(gòu)體。Quaranta等［41］提出了一個(gè)新的人乳脂肪球膜蛋白的提取方案，然后運(yùn)用2-DE進(jìn)行分離，并獲得了23個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，經(jīng)過序列分析，發(fā)現(xiàn)1種新蛋白質(zhì)的存在。乳脂球膜中的蛋白質(zhì)具有重要的生物學(xué)活性，這些蛋白質(zhì)大部分是未知的。因此，對(duì)乳脂球膜蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的研究有極其重要的意義。

2.4 乳鐵蛋白質(zhì)組學(xué)

乳鐵蛋白(lactoferrin，簡稱LF)又稱乳轉(zhuǎn)鐵蛋白，在哺乳動(dòng)物的乳汁中含量非常豐富。近些年來，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，許多國家開始意識(shí)到乳鐵蛋白的使用價(jià)值，因此利用蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)研究乳鐵蛋白有助于其在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用。Silvia Catinella等人［42］利用 MALDI-TOF/MS 技術(shù)研究了脫脂后的人初乳、人常乳蛋白質(zhì)的質(zhì)譜圖，發(fā)現(xiàn)隨著泌乳期的延長，乳鐵蛋白的重鏈呈遞減趨勢。石磊等［43］利用FT-ICR/MS技術(shù)對(duì)經(jīng)過脫脂的人乳乳脂、乳清和乳粒中的蛋白成分進(jìn)行了分析和鑒定，并在乳清和乳粒中獲得了乳鐵蛋白。王靜等人［44］利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)母乳進(jìn)行了分析，通過SDS-PAGE檢驗(yàn)免疫前后母乳中高豐度蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，得到了乳鐵蛋白的清晰條帶。David J Palmer等人［45］在研究脫脂人初乳中的低豐度蛋白時(shí)，利用SDS-PAGE檢測脫除高豐度蛋白的效果，通過初乳電泳圖譜分析，觀察到了乳鐵蛋白。Boesman-Finkelstein等人［46］利用SDS-PAGE分離技術(shù)對(duì)脫脂脫酪蛋白的人乳乳清液進(jìn)行了分析，獲得了乳鐵蛋白條帶。Manso.等［47］利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳 (CZE)的方法對(duì)人乳與牛乳進(jìn)行了差異蛋白的比較研究，并分析了不同泌乳階段下脫脂人乳中主要蛋白的電泳圖譜，同時(shí)以UHT(超高溫瞬時(shí)滅菌)牛乳做為對(duì)照，結(jié)果在3周時(shí)的人乳中出現(xiàn)了乳鐵蛋白的峰形，而這個(gè)峰形牛乳則沒有。

3 展望

蛋白質(zhì)組學(xué)作為乳蛋白質(zhì)研究的主要策略之一，雖然剛剛起步，卻能夠在蛋白質(zhì)水平上揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)及活性規(guī)律。隨著蛋白質(zhì)分離和鑒定技術(shù)的不斷發(fā)展，以及乳蛋白質(zhì)組圖譜和數(shù)據(jù)庫的不斷完善，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)人乳、牛乳蛋白質(zhì)組進(jìn)行全面、深入的研究，為尋找疾病的臨床診斷和治療、乳品加工保存條件、開發(fā)新型嬰幼兒食品提供重要的理論依據(jù)。但是，由于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)以及乳蛋白的復(fù)雜性，乳蛋白質(zhì)組的研究還存在一些問題，對(duì)乳中的低豐度蛋白的全方位的鑒定、比較還不是很成熟。乳蛋白的合成與降解、翻譯后修飾的表達(dá)分析是乳蛋白質(zhì)組學(xué)的核心問題，還具有一定的發(fā)展和研究空間。

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