雞大腸桿菌病的診斷技術(shù)及藥敏試驗(yàn)

劉相春 李永華 張紅霞 （山東省莒縣畜牧獸醫(yī)局 276500）

雞大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的禽類多種病型的總稱。常繼發(fā)于其他致病因子或與其它致病因子一同作用。大腸桿菌是雞腸道內(nèi)的常在菌，大部分大腸桿菌沒有致病性，研究表明禽致病性大腸桿菌的血清型主要有O1、O49、O36、O78等。有報道，初生雛雞由于感染大腸桿菌病，死亡率達(dá)50%。本文通過蛋雞大腸桿菌對抗生素及中藥的藥敏試驗(yàn)，來研究大腸桿菌的藥物敏感性，為科學(xué)合理選用抗菌藥物治療雞大腸桿菌病和防治雞大腸桿菌病提供理論依據(jù)，從而使蛋雞養(yǎng)殖戶減少經(jīng)濟(jì)損失，獲得更大的經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 無菌采取山東莒縣某蛋雞場病死雞，通過病原、流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化初步確診為大腸桿菌的雞肝、脾、肺等臟器6份，℃冰箱待檢。

1.1.2 培養(yǎng)基 普通營養(yǎng)瓊脂平板購于杭州天和微生物試劑有限公司；伊紅美藍(lán)瓊脂平板(EMB)購于上海市醫(yī)學(xué)化驗(yàn)所；鮮血瓊脂平板、各種生化試驗(yàn)培養(yǎng)基，均由本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.3 試驗(yàn)動物 健康昆明系小白鼠2只(16～20g)，購于泰安市生物制品研究所。健康20日齡雛雞10只，購于莒縣多利種禽場。

1.1.4 藥敏試驗(yàn) 藥敏片由本實(shí)驗(yàn)室自制。抗菌素種類為丁胺卡那、新霉素、慶大霉素、氟哌酸、鏈霉素、生山楂、呋喃妥因、大蒜、痢特靈、硫酸新霉素、硫酸阿米卡星11種。

1.2 方法

1.2.1 病料涂片染色鏡檢 將病料進(jìn)行觸片，進(jìn)行革蘭氏或美蘭染色，鏡檢。

1.2.2 分離培養(yǎng) 將病料無菌接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板、伊紅美藍(lán)瓊脂平板、血液瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24h，爾后進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.3 生化試驗(yàn) 用滅菌接種環(huán)勾取少許純培養(yǎng)物接種于各種生化培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18～24h后觀察結(jié)果。

1.2.4 動物試驗(yàn) 將純培養(yǎng)物制成菌懸液注射小白鼠2只，0.2ml/只。取分離株的細(xì)菌純培養(yǎng)物，以0.5ml/只(含活菌2～5億)的劑量分別頸部皮下接種3只1月齡健康易感雞;同時設(shè)2只空白對照；再取純培養(yǎng)物(含活菌2～5億)。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 將細(xì)菌純培養(yǎng)物用無菌生理鹽水洗下，稀釋并與麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行比濁，選取30×1010個/ml濃度的菌懸液，用無菌棉拭子蘸取稀釋液均勻涂布于普通平板，經(jīng)室溫干燥3～5min后，每塊平板貼藥敏紙片3片，37 ℃ 1 8 ～24h 培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 涂片染色鏡檢

觸片進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢見革蘭氏陰性、散在的小桿菌。

2.2 菌落形態(tài)及培養(yǎng)特性

普通營養(yǎng)瓊脂平板上形成圓形、中等大小、隆起、光滑、濕潤、不透明、邊緣整齊、灰白色的小菌落;鮮血瓊脂平板上生長良好，不溶血;EMB瓊脂平板上形成紫黑色帶金屬光澤的菌落。

2.3 生化試驗(yàn)

生化試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 大腸桿菌生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 細(xì)菌培養(yǎng)及生化鑒定結(jié)果

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表2 藥物平均抑菌圈直徑 (mm)

2.6 接種試驗(yàn)結(jié)果

分離菌株接種實(shí)驗(yàn)動物后，發(fā)現(xiàn)小白鼠于注射后精神萎靡，6～15h死亡2只。對死亡小白鼠解剖觀察，發(fā)現(xiàn)心臟出血、淤血，肝、脾出血壞死，腸壁變薄，有出血點(diǎn)。取其病料抹片染色鏡檢及分離培養(yǎng)均回收到接種細(xì)菌。所有試驗(yàn)雞在24h內(nèi)全部死亡，剖檢具有典型的雞大腸桿菌病變特征，并從病雞的心血中成功分離到相應(yīng)的病菌；對照組全部存活；用標(biāo)準(zhǔn)株攻毒的3只雞全部死亡，剖檢具有雞大腸桿菌的典型病變特征。

4 討論

大蒜、生山楂、痢特靈、硫酸新霉素，硫酸阿米卡星均高度敏感。這說明上述藥物可作為該雞場的首選治療藥物。多西環(huán)素、甲基新諾明、四環(huán)素、鏈霉素、土霉素等藥的抑菌效果較差，可能與其長期使用這些藥物而產(chǎn)生耐藥性有關(guān)[9]。因此，用藥時需合理配伍，不能隨意加大劑量，要定期更換不同類型的抗生素，以免產(chǎn)生耐藥菌株。藥敏試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，分離株和標(biāo)準(zhǔn)株對藥物的敏感性不同，總體看來，分離株不如標(biāo)準(zhǔn)株對受試藥物敏感，這可能與臨床上濫用藥物使分離菌株產(chǎn)生了一定的耐藥性有關(guān)。防治該病的關(guān)鍵在于貫徹“養(yǎng)重于防，防重于治”的方針。發(fā)病用藥時，應(yīng)首先對菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，再選擇敏感的藥物。該試驗(yàn)中大蒜的抑菌圈直徑很大，表明其有很強(qiáng)的抑菌作用，王桂亭也證實(shí)大腸桿菌對大蒜等中藥高度敏感。這說明在用藥時可以將中西藥物結(jié)合，并且可各藥交替使用。這樣就可以防止因?yàn)E用藥物出現(xiàn)耐藥菌株，并且使藥物防治更加合理化。

大腸桿菌不僅廣泛存在于雞群中，而且在不同地區(qū)和不同雞場的大腸桿菌的血清型又不盡相同，并且經(jīng)常處在變化之中大蒜、生山楂、痢特靈、硫酸新霉素，硫酸阿米卡星均高度敏感。這說明上述藥物可作為該蛋雞場的首選治療藥物。多西環(huán)素、甲基新諾明、四環(huán)素、鏈霉素、土霉素等藥的抑菌效果較差，可能與其長期使用這些藥物而產(chǎn)生耐藥性有關(guān)。

[1] 王永芬, 席磊. 雞致病性大腸桿菌生物學(xué)特性的相關(guān)性研究[J].中國家禽, 2007, 29(13): 13-15.

[2] 刁有祥, 禽病學(xué)[M]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社, 2008: 190-192.

[3] 郭利軍. 禽大腸桿菌藥敏紙片的制作[J]. 北方牧業(yè), 2008, 18(7): 14.

[4] 劉吉山, 沈志強(qiáng), 徐可利等. 雞大腸桿敏試驗(yàn)[J]. 中國獸藥雜志.2000, 32.

[5] 戴建君, 鄭明球, 蘭鄒然. 不同來源雞大腸桿菌致病性比較研究[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2001, 33(2): 3-5.

[6] 王桂亭, 宋艷艷, 王志波等. 大蒜液體外抑菌作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇, 2006(3). 3.