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    酶法提取海狗腎多肽的工藝研究

    2014-08-15 07:58:10董慧明
    實(shí)用藥物與臨床 2014年7期
    關(guān)鍵詞:多肽中性蛋白酶

    董慧明,才 鳳,高 聳

    0 引言

    海狗腎(又名海狗鞭)(Testis et Penis Callorhini)是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材,為海獅科動(dòng)物海狗(Callorhinus ursinus Linnaeus)及海豹科動(dòng)物多種海豹的雄性外生殖器[1]。早在《藥性論》就有膃肭臍的記載,海狗腎之名,出自《本草圖經(jīng)》,歷代本草均有發(fā)展,到了《本草綱目》已有6種之多[2],主要用于補(bǔ)腎壯陽,益精補(bǔ)髓,治虛損癆傷,陽痿精衰,腰膝痿弱[1]。海狗腎中富含多肽及蛋白質(zhì),是其主要的活性成分。大量研究結(jié)果表明,蛋白質(zhì)攝入后,并不完全水解成氨基酸,而是大部分以肽的形式吸收,同時(shí)發(fā)現(xiàn),多肽被吸收的速度比同組成的氨基酸要快[3]。大分子蛋白經(jīng)酶水解后可形成大量低分子多肽,海狗腎由于其來源有限,比較珍貴,目前國內(nèi)對(duì)海狗腎多肽的研究很少,本試驗(yàn)對(duì)酶解法制備海狗腎多肽工藝條件進(jìn)行了研究,酶解法在較溫和的條件下進(jìn)行,得到的海狗腎多肽既利于人體吸收,同時(shí)又不破壞海狗腎中的天然營養(yǎng)成分,能夠更好地保留海狗腎肽類及氨基酸成分的生物活性,為海狗腎的深度開發(fā)利用提供有效思路。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料 海狗腎(干品):為海豹雄性生殖器官,包括睪丸、附睪、精囊腺前列腺及陰莖,由加拿大進(jìn)口,為合法捕殺。取膨化后的海狗腎干品(海豹鞭),去其陰莖骨,切片干燥后粉碎,備用。

    1.2 主要儀器與試劑 ①儀器:U-2010紫外可見分光光度計(jì),日本島津公司;pH計(jì),上海虹益儀器儀表有限公司;電熱恒溫水浴鍋,河南鞏義市予華儀器有限公司;冷凍離心機(jī),河南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器發(fā)展有限公司;冷凍干燥機(jī),北京松源華興科技有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,河南鞏義市予華儀器有限公司;分析天平,德國賽多利斯儀器公司。②試劑:A.S1398精制中性蛋白酶(13萬U/g)、堿性蛋白酶(10萬U/g),無錫酶制劑廠產(chǎn),木瓜蛋白酶(80萬U/g)、胰酶(4 000U/g),廣西南寧龐博生物科技有限公司;牛血清蛋白(BSA),F(xiàn)olin-酚試劑,其他試劑均為分析純。

    1.3 工藝流程 海狗腎粉末→加水→加入蛋白酶水解→煮沸滅酶→低溫靜止l2 h→離心→上清液(海狗腎多肽混合物)→脫苦脫色→濃縮→冷凍干燥→海狗腎多肽粉末。

    1.4 酶解單因素實(shí)驗(yàn)

    1.4.1 水解酶的選擇 酶法水解動(dòng)物性蛋白的報(bào)道很多,綜合文獻(xiàn)研究和預(yù)試驗(yàn)[4-6],采用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶,在各酶最適反應(yīng)條件下進(jìn)行,并測定酶解液中多肽含量,進(jìn)一步選取試驗(yàn)用酶。

    1.4.2 酶解過程 取10 g海狗腎粉末,用選定的試驗(yàn)用酶進(jìn)行酶解,以酶解液中多肽含量為指標(biāo),分別對(duì)海狗腎多肽提取工藝的酶解時(shí)間、加酶量、加水量、pH值、酶解溫度5個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。

    1.5 正交方案設(shè)計(jì) 影響酶解反應(yīng)的幾個(gè)主要因素為加酶量、時(shí)間、pH、溫度和加水量。根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,并根據(jù)原料及選定蛋白酶的性質(zhì),酶解pH確定為7.0,選定加水量(A)、加酶量(B)、酶解溫度(C)、酶解時(shí)間(D)4個(gè)因素,分別設(shè)置3個(gè)水平,進(jìn)行正交試驗(yàn)L9(34)[7]。采用Folin-酚法測定酶解液海狗腎多肽含量并為指標(biāo)優(yōu)選酶解海狗腎多肽提取最佳工藝。其因素水平表見表1。

    表1 海狗腎多肽提取工藝正交試驗(yàn)因素水平表

    1.6 多肽含量的測定 采用Folin-酚法測定海狗腎水解液的多肽含量[8]。多肽得率(%)=多肽含量/海狗腎粉末質(zhì)量×100%。

    1.7 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單酶的選擇 取10 g海狗腎粉末,加8倍體積的水,分別添加堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰酶各1.0%,在各酶最適pH值和溫度下酶解5 h。由圖1可見,用中性蛋白酶進(jìn)行試驗(yàn)的酶解液中多肽含量最高,因此選擇A.S1398精制中性蛋白酶作為試驗(yàn)用酶。

    2.2 不同因素對(duì)酶解反應(yīng)的影響

    2.2.1 加酶量對(duì)多肽含量的影響 在酶解溫度為50 ℃、加水量8倍、pH 7.0的條件下進(jìn)行酶解試驗(yàn),分別加入中性蛋白酶0.2%、0.5%、1.0%、1.5%、2.5%,酶解5 h,檢測不同加酶量下的多肽含量。由圖2可知,隨著加酶量的增加多肽含量遞增,在加酶量為1.5%后曲線趨于平穩(wěn),說明在此之后增加加酶量對(duì)多肽含量無太大影響,因此正交試驗(yàn)重點(diǎn)考察0.5%~1.5%的加酶量對(duì)多肽含量的影響。 圖2為加酶量對(duì)多肽含量的影響。

    圖1 不同蛋白酶酶解多肽含量的比較

    圖2 加酶量對(duì)肽含量的影響

    2.2.2 加水量對(duì)多肽含量的影響 在酶解溫度為50 ℃、加酶量1.0%、pH 7.0的條件下進(jìn)行酶解試驗(yàn),分別加入中性蛋白酶,在加水量為4、6、8、10、12倍下酶解5 h,檢測不同加水量下的多肽含量。由圖3可知,加水量增加時(shí),水解度下降,其中加水量8倍時(shí),多肽含量最高??赡苁羌铀吭黾雍螅笣舛缺幌♂?,反而降低了多肽含量。在酶解過程中,加水量過少,反應(yīng)體系過于粘稠,會(huì)導(dǎo)致酶解反應(yīng)不充分,而加水量過多,則會(huì)增加后續(xù)處理的成本。因此正交試驗(yàn)選取加水量為5、7、9倍條件下進(jìn)行。

    2.2.3 底物溶液pH對(duì)多肽含量的影響 在酶解溫度為50 ℃、加水量8倍、加酶量1.0%的條件下進(jìn)行酶解試驗(yàn),分別加入中性蛋白酶,在pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0下酶解5 h,檢測不同pH下的多肽含量。由圖4可知,中性蛋白酶在pH 7.0的條件下酶解效果最好,酶解液中的多肽含量最高,而且反應(yīng)體系本身成中性,不用過多調(diào)節(jié)pH值,故正交試驗(yàn)選定在pH 7.0條件下進(jìn)行。

    圖3 加水量對(duì)多肽含量的影響

    圖4 pH對(duì)多肽含量的影響

    2.2.4 酶解溫度對(duì)多肽含量的影響 在加水量8倍、加酶量1.0%、pH 7.0的條件下進(jìn)行酶解試驗(yàn),分別加入中性蛋白酶,在溫度為40、45、50、55、65 ℃下酶解5 h,檢測不同溫度下的多肽含量。由圖5可知,多肽含量隨著溫度的增加呈遞增趨勢(shì),在50 ℃時(shí)水解度最高,再增加溫度則多肽含量開始下降。試驗(yàn)表明,中性蛋白酶的最佳酶解溫度在45~55 ℃之間。

    圖5 酶解溫度對(duì)多肽含量的影響

    2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)多肽含量的影響 在酶解溫度為50 ℃、加水量8倍、加酶量1.0%、pH 7.0的條件下進(jìn)行酶解試驗(yàn),分別加入中性蛋白酶,考察時(shí)間為1、2、4、6、8 h下的酶解效果,檢測不同酶解時(shí)間下的多肽含量。由圖6可知,多肽含量隨著酶解時(shí)間的增加呈遞增趨勢(shì),在酶解4 h時(shí)多肽含量曲線趨于平穩(wěn),說明在此之后延長水解時(shí)間對(duì)酶解液中多肽含量無太大影響,因此選擇3、4、5 h三個(gè)酶解時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。

    圖6 酶解時(shí)間對(duì)多肽含量的影響

    2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化 試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可見,四個(gè)因素的極差大小順序?yàn)锳>B>D>C,即加水量>加酶量>酶解時(shí)間>酶解溫度,各因素與水平的組合應(yīng)為A3B3D2C2。進(jìn)一步進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3。

    表2 正交試驗(yàn)表及結(jié)果

    表3 方差分析表

    查表得F0.05(2.2)=19.00,F(xiàn)0.0l(2.2)=99.00,經(jīng)方差分析,發(fā)現(xiàn)A因素極具顯著性,B因素有顯著意義,D因素接近顯著值,C因素?zé)o顯著意義,表明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)較有意義。結(jié)合R水平,得出海狗腎多肽提取最佳工藝條件:加水量為9倍量,加酶量1.5%,酶解溫度50 ℃,反應(yīng)時(shí)間4 h。即最佳提取工藝為A3B3D2C2。

    2.4 最佳工藝確定 精密稱取海狗腎粉末10 g,按上述最佳提取工藝A3B3D2C2提取3次,測定并計(jì)算海狗腎多肽的含量和多肽得率。結(jié)果見表4。

    表4 驗(yàn)證試驗(yàn)表

    通過正交驗(yàn)證試驗(yàn)可知,驗(yàn)證試驗(yàn)海狗腎多肽的含量均高于正交試驗(yàn)結(jié)果。

    3 結(jié)論

    本試驗(yàn)采用酶解法提取海狗腎多肽,并以海狗腎多肽含量為考察工藝的指標(biāo),通過單因素試驗(yàn)研究了加酶量、溫度、加水量、pH值和時(shí)間等因素對(duì)多肽含量的影響,并采用L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn),得出的優(yōu)化組合為A3B3D2C2,從而最終確定了用A.S1398中性蛋白酶提取海狗腎多肽的工藝條件為:加水9倍量,加酶量1.5%,酶解溫度50 ℃,酶解時(shí)間4 h,pH 7.0。在此條件下提取海狗腎多肽,多肽得率可達(dá)到48.41%。

    目前以海狗腎為原料的保健藥品劑型多為膠囊,如果制成膠囊服用則必須粉碎成粉末,而用常規(guī)的動(dòng)物藥粉碎方法對(duì)本品來說很困難,不易成粉[9]。本試驗(yàn)用酶解法提取海狗腎多肽得到多肽溶液,后冷凍干燥得到多肽粉末,該多肽粉末不僅顆粒微小,易于保存,而且除含有低分子多肽外,還含有大量的氨基酸、微量元素等活性成分,可直接開發(fā)成膠囊、軟膠囊、口含片及口服液等劑型的保健藥品,本試驗(yàn)得到的酶法提取海狗腎多肽工藝可操作性強(qiáng),適合規(guī)?;a(chǎn)。

    參考文獻(xiàn):

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