異氟醚對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶磷酸化的抑制效應(yīng)

邢 準(zhǔn)，張巖生，劉 坤，邱 鵬

0 引言

異氟醚是一種廣泛用于臨床的吸入全身麻醉藥物，可以對(duì)血壓、腦血流、腦代謝等有影響，甚至直接作用于神經(jīng)的電傳導(dǎo)和物質(zhì)代謝。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),異氟醚能夠?qū)е滦g(shù)后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率增高，并證實(shí)是其發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[1-2]。吸入麻醉藥可能通過(guò)抑制神經(jīng)元乙酰膽堿(Acetylcholine，ACh)受體發(fā)揮作用，乙酰膽堿受體包括毒蕈鹼型(mAChR) 和煙堿型(nAChR)，廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，與大腦的認(rèn)知功能密切相關(guān)。G蛋白偶聯(lián)的乙酰膽堿受體可以激活一系列蛋白激酶，包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(Extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)，ERK可調(diào)節(jié)突觸和神經(jīng)元的可塑性及學(xué)習(xí)和長(zhǎng)時(shí)程記憶形成[3]。蛋白激酶B(Protein kinase B，PKB)通路也是調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞生存、凋亡的重要通路。有研究表明,吸入全身麻醉藥物可以增加蛋白激酶B磷酸化從而發(fā)揮麻醉藥預(yù)處理作用[4-5]。本研究以體外培養(yǎng)的神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞為基礎(chǔ)，研究異氟醚處理對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的影響，探討揮發(fā)性麻醉藥影響認(rèn)知功能的分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco 公司)，新生牛血清(杭州四季青生物工程公司)，碘化乙酰膽堿(美國(guó)Sigma公司)，異氟醚(英國(guó)雅培公司)，抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。HERA CELL 150型CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus 公司)，TE2000-U 系列倒置顯微鏡(配有CCD 軟件，日本Nikon公司)，ULTIMA氣體濃度監(jiān)測(cè)儀(美國(guó)Ohmeda公司)，ABI7500定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)，Gbox-chemiHR-E電泳成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Gene公司)。

1.2 培養(yǎng)細(xì)胞及分組 高分化的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12)細(xì)胞株購(gòu)自北京金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。將復(fù)蘇后的PC12 細(xì)胞接種于涂有多聚賴氨酸的75 mL 培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液為含有10%新生牛血清和1%雙抗(青霉素和鏈霉素) 的DMEM 高糖培養(yǎng)基,在37 ℃、5 %CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。每3天傳代一次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12 細(xì)胞，以4×105/mL 的密度接種于24孔板，培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h后更換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，參考文獻(xiàn)[6]將培養(yǎng)板置于濃度1.2%的異氟醚密閉箱內(nèi)進(jìn)行處理2 h，采用ULTIMA氣體濃度監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)異氟醚濃度。分別于處理后0 min、1 h、3 h加入碘化乙酰膽堿(終濃度10 μM)刺激2 min后收集細(xì)胞，-80 ℃凍存。

1.3 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 采用RIPA buffer按照說(shuō)明書分離提取細(xì)胞總蛋白，取少量BCA法測(cè)定蛋白濃度，上樣量按每孔20 μg總蛋白，SDS-PAGE電泳(濃縮膠濃度5%，分離膠濃度8%)分離蛋白，半干法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上(10 V,1.5 h)。轉(zhuǎn)印膜用5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h，與TTBS緩沖液(含1%BSA)稀釋的抗p-ERK1/2(sc-7383，1∶500)和p-PKB(sc-101775，1∶1 000))一抗溶液4 ℃雜交過(guò)夜。洗膜后與1∶2 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫下孵育2 h，ECL 化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物信號(hào)，采用Gbox-chemiHR-E電泳成像分析系統(tǒng)拍照并計(jì)算蛋白條帶的光密度值。同樣步驟進(jìn)行內(nèi)參GAPDH(sc-48166)測(cè)定，每個(gè)樣本重復(fù)3次取平均值，目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量以其與內(nèi)參GAPDH的光密度相對(duì)比值表示。

2 結(jié)果

2.1 異氟醚對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)的ERK1/2的磷酸化水平的影響 與對(duì)照組比較，單純異氟醚處理對(duì)PC12細(xì)胞中ERK1/2磷酸化水平?jīng)]有明顯影響，而單純ACh刺激可導(dǎo)致ERK1/2磷酸化水平顯著增加(P<0.01)，但異氟醚處理可明顯阻礙ACh 升高ERK1/2磷酸化的效應(yīng)(P<0.01)。這種干擾作用持續(xù)存在，異氟醚處理1 h后，PC12細(xì)胞中ERK1/2磷酸化水平仍然明顯低于單純ACh刺激組(P<0.01)。至異氟醚處理3 h后，兩組細(xì)胞中ERK1/2磷酸化水平?jīng)]有明顯差異。

2.2 異氟醚對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)的蛋白酶B的活性的影響 單純ACh刺激對(duì)PKB磷酸化水平?jīng)]有明顯影響。與之相反，異氟醚處理可明顯增加PC12細(xì)胞中基礎(chǔ)狀態(tài)下PKB的磷酸化水平(P<0.05)，異氟醚和乙酰膽堿共同處理導(dǎo)致PKB磷酸化水平達(dá)峰值(P<0.05)。異氟醚處理1 h后，PC12細(xì)胞中PKB的磷酸化水平略高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.082)。異氟醚處理3 h，后PKB磷酸化完全恢復(fù)正常水平。

3 討論

術(shù)后認(rèn)知功能障礙是術(shù)后常見的并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為幻視、幻聽、情緒狀態(tài)的改變和學(xué)習(xí)記憶功能的下降。術(shù)后認(rèn)知功能障礙發(fā)病率較高，其影響因素眾多，確切發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，可能與年齡、手術(shù)應(yīng)激及麻醉藥等相關(guān)。異氟醚是全身麻醉的主要用藥之一，在臨床工作中廣泛使用。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，異氟醚能夠?qū)е滦g(shù)后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率增加，是后者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[7-8]。基于動(dòng)物模型研究也證實(shí)，異氟醚等吸入麻醉藥物能夠影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶功能，降低大鼠的認(rèn)知能力，機(jī)理可能與麻醉藥改變了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的蛋白表達(dá)相關(guān)[9-10]。

圖2 PC12細(xì)胞中ACh刺激對(duì)PKB活性的影響以及異氟醚處理的協(xié)同效應(yīng)

乙酰膽堿是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與意識(shí)活動(dòng)、學(xué)習(xí)記憶等多種復(fù)雜功能[11]。Fernandes 等[12]發(fā)現(xiàn)，ACh受體缺陷的小鼠存在學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知能力低下的現(xiàn)象。膽堿能系統(tǒng)阻滯同樣引起人類記憶、學(xué)習(xí)功能減退，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶力損害為主的阿爾茨海默病與膽堿能系統(tǒng)活性下降密切相關(guān)[13]。乙酰膽堿受體廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，與大腦的認(rèn)知功能密切相關(guān)。G蛋白偶聯(lián)的mAChRs 可以激活一系列信號(hào)通路，包括RAS-ERK通路，除了調(diào)控細(xì)胞增殖和分化，該通路的激酶ERK1/2在成熟的神經(jīng)元中也大量富集，參與調(diào)節(jié)突觸和神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能可塑性及學(xué)習(xí)和長(zhǎng)時(shí)程記憶形成。RAS-ERK信號(hào)通路損壞的小鼠在水迷宮訓(xùn)練中喪失記憶水下平臺(tái)的能力[14]。

研究表明，乙酰膽堿在中樞的傳遞可能是吸入性麻醉藥的作用靶點(diǎn)之一，多種吸入性麻醉藥可以強(qiáng)烈而可逆地抑制神經(jīng)元中的乙酰膽堿受體，可能由此產(chǎn)生失憶效應(yīng)[15]。本研究以高分化的褐家鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞為基礎(chǔ)，研究異氟醚是否干擾神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿對(duì)信號(hào)通路關(guān)鍵激酶的誘導(dǎo)效應(yīng)。結(jié)果顯示，單純乙酰膽堿刺激可快速增加神經(jīng)樣細(xì)胞中ERK1/2的磷酸化水平，單純異氟醚處理對(duì)ERK信號(hào)通路沒有影響，但是異氟醚可以作用于乙酰膽堿受體，從而阻斷乙酰膽堿對(duì)ERK信號(hào)通路的刺激作用。這種阻斷效應(yīng)在終止異氟醚處理后，仍可持續(xù)1 h以上，分析可能是細(xì)胞結(jié)構(gòu)中少量殘留的脂溶性異氟醚即足以阻斷乙酰膽堿的作用。異氟醚雖然自身對(duì)ERK1/2的活性沒有影響，但可明顯增加PKB的磷酸化水平，與以往的報(bào)道相一致[16]。但與對(duì)ERK的間接影響效應(yīng)相比較，這種刺激效應(yīng)很短暫，說(shuō)明神經(jīng)元樣細(xì)胞內(nèi)不同的信號(hào)通路對(duì)異氟醚處理的效應(yīng)濃度和效應(yīng)時(shí)程也不相同，提示在麻醉術(shù)后體內(nèi)殘留的異氟醚可能主要通過(guò)干擾乙酰膽堿相關(guān)的ERK信號(hào)通路，從而影響認(rèn)知功能。

總之，本實(shí)驗(yàn)在體外研究初步證實(shí)異氟醚可以長(zhǎng)時(shí)程減弱乙酰膽堿誘導(dǎo)的蛋白激酶活化，從而干擾胞內(nèi)信號(hào)傳遞，這可能與術(shù)后認(rèn)知功能障礙發(fā)生密切相關(guān)。未來(lái)有必要采用動(dòng)物模型進(jìn)一步研究異氟醚對(duì)膽堿能神經(jīng)元的胞內(nèi)信號(hào)通路的影響，探討麻醉后認(rèn)知功能障礙發(fā)生的分子機(jī)制。

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