卵子玻璃化冷凍在體外受精－胚胎移植取精失敗周期中的應(yīng)用

耿 潔，胡玉琴，劉蘭蘭

(1.中國人民解放軍第174醫(yī)院生殖中心，福建 廈門 361000;2.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230000)

隨著玻璃化冷凍技術(shù)的臨床應(yīng)用，卵子冷凍技術(shù)獲得了很大的進(jìn)展，甚至可以得到與新鮮卵子相同的妊娠率［1］，這樣，可以通過卵子的冷凍保存來解決體外受精－胚胎移植(IVF－ET)中因男方因素?zé)o法獲得精子的問題。本文分析2010年8月至2012年8月，在我院生殖醫(yī)學(xué)中心取卵日取精失敗接受卵子冷凍－解凍的5例患者的臨床結(jié)局，探討卵子玻璃化冷凍技術(shù)在取精失敗周期中應(yīng)用的可行性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 自2010年起我院生殖醫(yī)學(xué)中心對(duì)進(jìn)行IVF－ET治療中，因取卵日無法獲得精子的卵子進(jìn)行玻璃化冷凍。知情同意書經(jīng)倫理委員會(huì)討論并通過。5例患者的玻璃化冷凍保存的卵子解凍后進(jìn)行了顯微授精(ICSI)治療。平均年齡35.4歲，不育時(shí)間平均5.8年。均因男方因素取卵日無法獲得精子進(jìn)行全部的卵子冷凍保存。

1.2 卵子凍融方法 冷凍液分為平衡液和冷凍液，4℃保存，使用前取出室溫(25℃)平衡30 min。將卵子置于ES表面，室溫下放置，卵子自然下沉，出現(xiàn)皺縮再回復(fù)，當(dāng)卵子膨大到最大程度時(shí)(至少回復(fù)80%)，迅速用巴氏吸管取出卵子。整個(gè)過程大約5 min，一般不超過15 min;然后將其放入VS，在VS中3個(gè)不同的位置用吸管進(jìn)行吸放，時(shí)間不超過30～60 s，將卵子以最小液滴體積轉(zhuǎn)移至玻璃化冷凍載體上，迅速置入液氮中，標(biāo)記保存。卵子的復(fù)蘇液分為1、2、3、4，均由我生殖中心實(shí)驗(yàn)室配制。使用前，1在37℃平衡30 min，其他解凍液室溫(25℃)平衡30 min。將載體Crytop從液氮中取出，迅速將前端葉片浸入1中，1 min內(nèi)卵子脫落到1中。將卵子轉(zhuǎn)移至2內(nèi)，放置3 min，卵細(xì)胞部分恢復(fù)至冷凍前形態(tài)，但仍未恢復(fù)至冷凍前形態(tài)。再將卵子依次置于3和4中各5 min，卵子形態(tài)將完全恢復(fù)，然后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中培養(yǎng)。對(duì)所有解凍后的卵子均采用ICSI方式進(jìn)行授精。

2 結(jié)果

5例患者均解凍了取卵日實(shí)施全部冷凍保存的卵子。共復(fù)蘇卵子 35枚，存活 24枚，復(fù)蘇率68.57%;有24枚MⅡ卵子行ICSI，受精22枚，受精率91.67%;形成19枚胚胎，卵裂率86.36%，獲可用胚胎16枚。5個(gè)移植周期移植胚胎13枚，臨床妊娠 2例，分娩 2個(gè)健康嬰兒，胚胎種植率15.38%，活產(chǎn)率40%。剩余冷凍胚胎3枚。

3 討論

玻璃化冷凍技術(shù)是一門新興技術(shù)，其基本原理是細(xì)胞及其保護(hù)劑溶液以足夠快的降溫速率，由液態(tài)轉(zhuǎn)化為外形類似玻璃狀的非晶體化固體狀態(tài)，由于玻璃化液在低溫時(shí)黏稠度變得很高而不結(jié)晶，形成形態(tài)不規(guī)則的玻璃樣固體，并保留了細(xì)胞內(nèi)外液體正常的分子和離子分布，從而避免產(chǎn)生冷凍損傷［2］。細(xì)胞在冷凍過程中容易形成冰晶，損傷細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，對(duì)細(xì)胞造成致命的傷害，而玻璃化冷凍就可以很好地解決這一問題。

隨著1998年首次用玻璃化冷凍人類胚胎并獲成功妊娠，玻璃化冷凍被廣泛應(yīng)用于胚胎及卵子的冷凍。卵子冷凍為女性患者保存生育力提供了最大希望，也為臨床特殊病例提供了保障。目前卵子玻璃化冷凍保存技術(shù)被認(rèn)可，近年在臨床上也開始逐步應(yīng)用。Cobo等［3］對(duì)照分析研究了2005～2009年的4282枚玻璃化冷凍卵子、3524枚新鮮卵子和361枚慢速冷凍的卵子，結(jié)果顯示玻璃化冷凍復(fù)蘇卵子在受精率、胚胎形成率及妊娠率與新鮮卵子相似，比慢速冷凍的卵子生存率及受精率高。Smith等［4］通過前瞻性對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍與程序化冷凍比較，復(fù)蘇率、臨床妊娠率有顯著的差異。穩(wěn)定成熟的卵子冷凍技術(shù)是臨床應(yīng)用的前提，本中心只獲得了68.57%的復(fù)蘇率，可能與經(jīng)驗(yàn)不足有關(guān)，但是獲得了一定的妊娠率，避免了過去因取卵日取精失敗而丟棄卵子的現(xiàn)象。

近年卵子玻璃化冷凍應(yīng)用取得了顯著成效，但技術(shù)的有效性仍需評(píng)價(jià)，尤其是高濃度冷凍保護(hù)劑的影響和標(biāo)本直接與液氮接觸帶來的污染問題，還有冷凍技術(shù)本身帶來的一定遺傳風(fēng)險(xiǎn)都決定今后研究方向應(yīng)為冷凍方法的優(yōu)化與安全性。對(duì)936例［5］通過卵子冷凍保存出生的嬰兒調(diào)查顯示，其中392例玻璃化冷凍，532例通過慢速冷凍，均未增加出生缺陷風(fēng)險(xiǎn)。Wennerholm等［6］發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍卵子出生的221例孩童與正常出生體重?zé)o差異。有限的資料提示是安全的，但還需要進(jìn)一步的研究［7］。從我們目前的初步研究來看，卵子的玻璃化冷凍保存可以獲得一定的臨床妊娠率［8］，對(duì)IVF－ET治療中取精失敗患者可以作為臨床治療的一個(gè)供選擇的方法。

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