響應(yīng)面法優(yōu)化短梗五加中刺五加苷B和E的超聲提取工藝

史偉國(guó)，崔立勇，2，佟 慶，2，袁 寰，吳莉莉，周清波，李 洋

(1.佳木斯大學(xué)，黑龍江佳木斯 154007;2.黑龍江省合江林業(yè)科學(xué)研究所黑龍江佳木斯 154002)

短梗五加(Eleutherococcus sessiliflorus)，又名無(wú)梗五加，為五加科五加屬(Eleutherococcus)多年生落葉植物［1］。近年來(lái)，隨著刺五加藥用的發(fā)展，野生資源出現(xiàn)相對(duì)緊缺的狀況，短梗五加的藥用價(jià)值越來(lái)越得到人們的重視。研究表明，短梗五加短梗五加中含有大量的苷類物質(zhì)，其中刺五加苷B、E為主要的活性成分［2］。刺五加苷E是具有明顯的抗應(yīng)激反應(yīng)的作用，有抗炎、抗疲勞、抗菌、抗氧化、降血糖、保肝等多種生物活性［3－4］。因此，筆者采用高效液相色譜法對(duì)短梗五加莖皮中的刺五加苷B和刺五加苷E的含量進(jìn)行測(cè)定，并應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化刺五加苷B、E的提取條件，以期為刺五加苷B、E的開(kāi)發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象。短梗五加，采于雙鴨山市嶺東苗圃，經(jīng)鑒定為五加科五加屬(Eleutherococcus)多年生落葉植物。

1.1.2 主要儀器。Agilent 1100高效液相色譜儀，購(gòu)自Agilent公司;KQ-500DE型數(shù)控超聲清洗器，購(gòu)自昆山超聲儀器有限公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，購(gòu)自上海亞榮生化儀器廠。

1.1.3 主要試劑。刺五加苷B、E對(duì)照品，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，苷B批號(hào):20130724，苷E批號(hào):20130729;所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1 短梗五加刺五加苷B、E含量測(cè)定。刺五加苷B、刺五加苷E的測(cè)定參考文獻(xiàn)［5－9］(HPLC法測(cè)定刺五加不同部位刺五加苷B、E含量)的方法獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。

1.2.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取料液比、提取時(shí)間和甲醇濃度3因素，采用響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化刺五加苷 B、E 的甲醇超聲提取工藝參數(shù)［10－11］。精密稱取3.000 g短梗五加粉末，按試驗(yàn)方案中的條件甲醇超聲提取2次，取上清液旋轉(zhuǎn)蒸干加甲醇定容，采用高效液相色譜法測(cè)定刺五加苷B、刺五加苷E的得率。

表1 刺五加苷B、E提取響應(yīng)面法試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系的考察 由表2可知，刺五加苷B、刺五加苷E在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 刺五加苷B、E的HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程

2.2 回歸方程的建立及統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn) 將所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Design-Expert7.1.3 軟件分析，得到刺五加苷 B(1)、E(2)的二元多次回歸方程為:

由回歸方程可見(jiàn)，失擬項(xiàng)不顯著(P＜0.05)，說(shuō)明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾很小。刺五加苷B的擬合檢驗(yàn)極顯著(P＜0.01)，刺五加苷E的擬合檢驗(yàn)顯著(P＜0.05)，同時(shí)苷B的R2=0.982 4，苷E的R2=0.897 2，說(shuō)明模型擬合程度很好，所以所得的回歸方程能較好的分析刺五加苷B、E提取得率隨各參數(shù)的變化規(guī)律。

2.3 刺五加苷B、E提取的響應(yīng)面分析 根據(jù)刺五加苷B、E的響應(yīng)面的3維圖分析3個(gè)因素對(duì)苷B和苷E得率的影響(圖1)。圖1(A)表明，刺五加苷B得率與甲醇濃度為2次拋物線關(guān)系，在45%～50%范圍內(nèi)出現(xiàn)峰值。刺五加苷B得率隨料液比的增加顯著增加(P＜0.05)，呈上升趨勢(shì)。圖1(B)表明，提取時(shí)間對(duì)刺五加苷B得率的影響，變化趨勢(shì)受甲醇濃度的交互作用影響。圖1(C)表明，料液比對(duì)刺五加苷得率的影響，當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，刺五加苷B得率隨著料液比的增加而增加，呈直線上升趨勢(shì)。

圖2(A)表明，刺五加苷E得率隨甲醇濃度的升高而增加，隨著料液比的增加也顯著增加(P＜0.05)，但從價(jià)格、能耗等方面考慮，甲醇濃度取40% ～50%，料液比為1∶40時(shí)，刺五加苷E得率較高且變化不大。圖2(B)表明，在提取時(shí)間為70～75 min，料液比1∶35～1∶40時(shí)刺五加苷E得率最好。圖2(C)表明，刺五加苷E得率隨著提取時(shí)間的增加先減少后增加，在提取時(shí)間為75 min時(shí)，甲醇濃度的變化對(duì)苷E的得率影響不大。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

圖1 料液比、甲醇濃度和提取時(shí)間對(duì)刺五加苷B得率的影響

圖2 料液比、甲醇濃度和提取時(shí)間對(duì)刺五加苷E得率的影響

3 結(jié)論

超聲提取法與其他的傳統(tǒng)提取方法——冷浸法、回流法相比具有提取效率高、耗能少等優(yōu)點(diǎn)。試驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)考察了料液比、甲醇濃度、超聲提取時(shí)間對(duì)刺五加苷B、E的影響。通過(guò)響應(yīng)面分析方法，建立了超聲輔助提取短梗五加根莖中刺五加苷B、E的數(shù)學(xué)模型，回歸方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.982 4和0.897 5，方程擬合良好。通過(guò)響應(yīng)面分析優(yōu)化刺五加苷B最佳提取工藝條件為:甲醇濃度為52.46%，超聲提取時(shí)間75 min，料液比為40 g/ml;刺五加苷E最佳提取工藝條件為:甲醇濃度49.36%，超聲提取時(shí)間75 min，料液比為40 g/ml。

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