巖黃連引種栽培組織培養(yǎng)化學(xué)成分及提取測(cè)定研究進(jìn)展①

陸瑞群，林艷明，龐廣福

（右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000）

巖黃連（Corydalis Saxicola Bunting），全草含脫氫卡維?。◣r黃連堿）等活性成分［1］，具有顯著的抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛和強(qiáng)安定作用，并有抑制腫瘤細(xì)胞作用；主治瘡癤腫毒、肝炎、肝硬化、肝癌等癥，因此，對(duì)巖黃連進(jìn)行研究有著重要的意義。巖黃連為巖溶石山地區(qū)特有的多年生草本藥材植物，局限分布裸露石山，生于石縫、石穴。由于生長(zhǎng)環(huán)境條件惡劣，巖黃連自然繁殖率很低，種群發(fā)展困難，資源蘊(yùn)藏量十分有限［2］。本文對(duì)巖黃連的引種栽培、組織培養(yǎng)、化學(xué)成分、提取分離及含量測(cè)定的研究進(jìn)展進(jìn)行了概述。

1 引種栽培

1.1 種子繁殖研究 蔣運(yùn)生等［3］對(duì)巖黃連的種子研究發(fā)現(xiàn)，三種不同的貯藏種子的方法當(dāng)中，以紙袋密封置于低溫貯藏最好，發(fā)芽率最高，為25.75%；來(lái)自巖黃連果穗基部、中部和頂部的種子，以著生在中部的發(fā)芽率最高，為28.75%；不同類型的播種基質(zhì)中，以火土加肥泥，發(fā)芽率最高，為21.25%。

1.2 栽培研究 蔣水元等［2］曾報(bào)道，巖黃連對(duì)溫度的適應(yīng)性較廣，在－4.2℃～39.4℃范圍內(nèi)未表現(xiàn)出受危害癥狀，最適宜植株生長(zhǎng)的溫度為10℃～20℃；巖黃連對(duì)水分條件的要求是耐旱而怕淹窒，但充足的水分更有利于植株的生長(zhǎng)；巖黃連對(duì)光照條件的要求是耐弱光而忌強(qiáng)光；巖黃連對(duì)黑色石灰土和酸性紅壤都有較強(qiáng)的適應(yīng)性，以有機(jī)質(zhì)含量豐富、疏松、排水良好的沙壤土或輕壤土為佳。

巖黃連主要以種子繁殖，一般每年3～4月份起播種育苗，60d后可移苗栽植。適合生長(zhǎng)在堿性的沙壤土，特別是在溫度適宜、土質(zhì)肥沃、光照適度、空氣清涼的巖洞內(nèi)。種植兩年后可進(jìn)入盛產(chǎn)期［4］。蔣水元等［5］曾報(bào)道巖黃連的種植方法，包括種苗繁殖技術(shù)、栽培定植技術(shù)以及田間管理技術(shù)。韋忠福等［6］也對(duì)巖黃連的種植栽培技術(shù)進(jìn)行了介紹，包括生產(chǎn)基地的選擇、種苗的培育、定植，以及田間管理。

1.3 巖黃連的病害及防治 陳元生等［7］曾報(bào)道巖黃連主要有莖基腐病、灰霉病、病毒病三種病害以及對(duì)這三種病害的綜合防治措施。蔣水元等［5］曾報(bào)道巖黃連的主要病害有猝倒?。ú≡罕廾鷣嗛T真菌的瓜果腐霉菌）、白粉?。ú≡鹤幽揖鷣嗛T白粉菌屬真菌）和莖基腐?。ú≡喊胫惼咸焰邔?、子囊菌門葡萄核盤菌屬）?？赏ㄟ^苗床土壤消毒、噴藥防治、生態(tài)防治以及加強(qiáng)栽培管理等方法進(jìn)行病毒防治。

1.4 人工栽培藥材與野生藥材的主成分量比較 黃瑋等［8］采用高效液相色譜法以及紫外分光光度法分別測(cè)定巖黃連藥材中的脫氫卡維丁以及生物總堿，發(fā)現(xiàn)人工栽培的巖黃連藥材所含的脫氫卡維丁以及生物總堿均比野生巖黃連要高。

2 組織培養(yǎng)

程華等［9］分別用巖黃連的葉、莖、根作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，發(fā)現(xiàn)葉片誘導(dǎo)率最高，誘導(dǎo)速度最快，表明葉片最適合誘導(dǎo)愈傷組織。陸瑞群［10］對(duì)巖黃連的組織培養(yǎng)進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)巖黃連種子的萌發(fā)需要經(jīng)過低溫的誘導(dǎo)，種子萌發(fā)率為69.2%。在消毒時(shí)間對(duì)莖尖消毒效果的影響實(shí)驗(yàn)中，得出較好的滅菌時(shí)間是6min，此時(shí)莖尖的成活率為30%。另外研究發(fā)現(xiàn)，B5是較好的誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基。在不同BA濃度對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)中，得出較適合巖黃連繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為 MS＋BA0.1＋NAA0.01。在不同濃度TDZ對(duì)誘導(dǎo)芽的影響的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)較好的誘導(dǎo)叢生芽的培養(yǎng)基為 MS＋TDZ0.2＋NAA0.01。在不同濃度聚乙烯醇（PVA）對(duì)巖黃連玻璃化苗逆轉(zhuǎn)影響的實(shí)驗(yàn)中，PVA濃度為2g／L時(shí)，逆轉(zhuǎn)率最高為20%。蘇江等［11］研究發(fā)現(xiàn)，葉柄和葉片的愈傷組織誘導(dǎo)率明顯高于莖節(jié)和莖尖，其中葉片誘導(dǎo)率最高為46.67%，而莖尖愈傷組織的再分化率最高為66.7%。

3 化學(xué)成分

從巖黃連中分離鑒定出的化合物有：小檗堿（berberine）、脫氫卡維丁（dehydrocavidine）、卡維丁［（±）cavidine］、β－羥基白屈菜紅堿（chelerythrine）、（—）斯庫(kù)來(lái)堿［（—）scoulerine］、原阿片堿 （protopine）、白 蓬 葉 堿 ［（＋）thalictrifoline］、沙 明 堿（corysamine）、非 洲防己堿（columbamine）、去 氫 碎 葉 紫 堇 堿（dehydrocheilanthifoline）、黃 連堿 （coptisine）、去氫巖 黃 連 堿（dehydrocavidine）、齊墩果酸（oleanolic acid）、刺檗堿（oxvacanthine）、胡蘿卜苷（daucosterol）、別隱品堿（allocryptopine）、β－谷甾醇（β－sitosterol）、白樺脂醇（betulin）、環(huán)桉烯醇（cycloeucalenol）、白樺脂酸（betulinic acid）、β－香樹脂醇乙酸酯（βamyrin acetate）、四氫掌葉防己堿（tetrahydropalmatine）、巴馬汀（palmatine1）、1－硝基阿卟卡維丁、8－羥基－9－甲氧基－11－硝基－利瑞尼堿、脫氫異阿卟卡維丁、3－甲氧基－2，9，10－三羥基四氫原小檗堿、5－甲氧－6－甲基吲哚－1－甲醛、2羥基－5－甲氧－6－甲基吲哚－1－甲醛、（－）－2，9－dihydroxyl－3，11－dimethoxy－1，10－dinitrotetrahydroprotoberberine、（＋）－4－nitroisoapocavidine［12－15］。

4 提取分離

李倩霞等［16］研究大孔吸附樹脂分離巖黃連總生物堿，提取工藝為：上樣藥液原藥材濃度0.2g／ml，吸附流速為2BV／h，解吸附溶劑為60%乙醇（3BV），所得巖黃連提取物中總生物堿含量大于60%。王靜等［17］用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選巖黃連藥材的最佳提取工藝，提出最佳工藝條件為：用75%乙醇提取，每次加醇量10倍，提取3次，每次提取時(shí)間2h，優(yōu)選得到的工藝簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可行。蔣偉哲等［18］用醇—酸水—氯仿的方法從巖黃連中提取出總生物堿，然后采用制備色譜系統(tǒng)從中分離出巖黃連堿，產(chǎn)品經(jīng)HPLC檢測(cè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)99%以上，而且該方法先進(jìn)，重復(fù)性好。劉朝亮等［19］采用高速逆流色譜法制備分離巖黃連中的脂溶性生物堿，快速、簡(jiǎn)便、產(chǎn)物得率和純度較高。其工藝條件為：正己烷－醋酸乙酯－甲醇－水（3∶7∶5∶5；1.5∶5∶1.5∶5）、正已烷－醋酸乙酯－甲醇－0.2mol／L鹽酸（1∶3.5∶2.5∶4.5），上相作固定相，下相作流動(dòng)相，轉(zhuǎn)速860r／min，流速1.2ml／min。Deng J等［20］研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用微波聯(lián)合高速逆流色譜法可有效地提取、分離和純化脫氫卡維丁。梁鎮(zhèn)然等［21］用高速逆流色譜與硅膠柱層析聯(lián)用分離巖黃連中的2種原小檗堿型季胺生物堿，該方法降低了反復(fù)的柱層析導(dǎo)致的樣品損失。

5 含量測(cè)定

對(duì)巖黃連總生物堿或巖黃連有效成分的含量測(cè)定主要有四種方法：高效液相色譜法（HPLC）、反相高效液相色譜法（RP－HPLC）、高效液相色譜－質(zhì)譜法（HPLC－MS／MS）及分光光度法，其中使用較多的是高效液相色譜法。陸益等［22］用HPLC法測(cè)定巖黃連中不同部位脫氫卡維丁的含量，采用Zorbax ODS C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，以乙腈—0.05mol／L磷酸二氫鉀溶液（用10%KOH調(diào)pH 至5.0）（85∶15）為流動(dòng)相，流速1.0ml／min，檢測(cè)波長(zhǎng)為347nm，柱溫為室溫。結(jié)果：脫氫卡維丁在2.51～75.36μg／ml（r＝0.99999，n＝7）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為99.86%，RSD為0.58%，該法簡(jiǎn)單、快速、重現(xiàn)性好，適用于巖黃連中脫氫卡維丁的定量分析。羅遠(yuǎn)秀等［23］用HPLC測(cè)定巖黃連注射液中巖黃連堿的含量，方法：Luna C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈－水（1∶1，1 000ml含磷酸二氫鉀3.4g，十二烷基硫酸鈉1.7g），流速1.0ml·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)347nm，柱溫為室溫。結(jié)果：巖黃連堿在5.48～49.34μg·ml－1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r＝1.0000）；平均加樣回收率為99.96% ，RSD＝0.41%（n＝6）。黃雪梅等［24］采用反相高效液相色譜法對(duì)巖黃連堿進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果：巖黃連堿進(jìn)樣量在0.106～2.12 μg范圍內(nèi)，與峰面積分值呈良好的線性關(guān)系（r＝0.9999）；平均加樣回收率為100.83%（RSD＝1.15%，n＝5）。程華等［25］用分光光度法測(cè)定巖黃連不同部位總生物堿的含量。采用氟仿超聲提取巖黃連不同部位樣品，依據(jù)酸性染料比色法的原理，以鹽酸小檗堿為對(duì)照，溴甲酚綠為指示劑，在416nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定樣品中總生物堿含量。結(jié)果吸光度值與生物堿含量線性關(guān)系良好（r＝0.9991）；回收率為101.91%，RSD為1.75%；測(cè)定結(jié)果在3h內(nèi)穩(wěn)定，RSD為1.09%。龔志強(qiáng)等［26］用HPLC測(cè)定廣西4個(gè)產(chǎn)地野生巖黃連藥材中脫氫卡維丁的含量，發(fā)現(xiàn)廣西4個(gè)不同縣產(chǎn)巖黃連藥材脫氫卡維丁含量差異明顯。

6 展望

目前，對(duì)巖黃連的研究已經(jīng)涉及引種栽培、生藥鑒別、植物生理、細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、化學(xué)成分、提取分離、含量測(cè)定、藥理作用、臨床應(yīng)用及基因組DNA等方面，研究面較廣但是研究深度不夠。有關(guān)巖黃連研究的文獻(xiàn)資料還相對(duì)較少，這可能與巖黃連的生境條件惡劣以及資源蘊(yùn)藏量低有關(guān)。在巖黃連的引種栽培過程中應(yīng)當(dāng)實(shí)行規(guī)范化種植，加強(qiáng)良種選育、無(wú)公害病蟲防治方面的研究；在組織培養(yǎng)方面，還需繼續(xù)研究，找到適合規(guī)?；a(chǎn)的配方和條件；對(duì)巖黃連化學(xué)成分的研究主要集中在生物堿成分的研究，而對(duì)無(wú)機(jī)成分、氨基酸、糖類等成分的研究較少；在提取分離方面，還需繼續(xù)研究，找到適合規(guī)模化生產(chǎn)的方法和工藝條件。

［1］ 程華，周蓬蓬，余龍江，等.瀕危植物巖黃連葉片中基因組DNA的提取及分析［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17（9）：1699－1700.

［2］ 蔣水元，胡興華，趙瑞峰.巖黃連引種栽培研究［J］.廣西植物，2002，22（5）：469－473.

［3］ 蔣運(yùn)生，朱鴻杰，蔣水元，等.巖黃連種子繁殖研究［J］.廣西科學(xué)，2006，13（4）：324－326.

［4］ 韋桂杰，羅平意.巖黃連人工栽培初見成效［J］.廣西林業(yè)，2006，3（5）：58－59.

［5］ 蔣水元，韋霄，李虹，等.巖黃連規(guī)范化種植標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范（SOP）［J］.廣西植物，2006，26（6）：675－680.

［6］ 韋忠福，王冬梅，楊得坡，等.瀕危野生藥材巖黃連人工栽培技術(shù)［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17（12）：2404－2405.

［7］ 陳元生，蔣林，韋忠福，等.巖黃連主要病害的綜合防治［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，23（12）：52－53.

［8］ 黃瑋，陸兔林，王巧晗，等.野生與人工栽培巖黃連藥材的比較［J］.中草藥，2008，39（5）：770－772.

［9］ 程華，余龍江.巖黃連離體細(xì)胞培養(yǎng)及生物堿成分分析［J］.武漢科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，30（2）：207－210.

［10］ 陸瑞群.巖黃連的地質(zhì)背景及組織培養(yǎng)技術(shù)研究［D］.桂林：廣西師范大學(xué)，2006：1－5.

［11］ 蘇江，岑忠用，鄧晰朝，等.不同外植體類型誘導(dǎo)巖黃連愈傷組織和再分化的初步研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，40（17）：13－16.

［12］ 毛宇昂，梁永紅.巖黃連的研究綜述［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17（4）：630－631.

［13］ 韋記青，蔣水元，蔣運(yùn)生，等.藥用植物巖黃連研究概述［J］.廣西科學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，22（2）：108－111.

［14］ 王奇志，梁敬鈺，原悅.巖黃連化學(xué)成分［J］.中國(guó)天然藥物，2007，5（1）：31－34.

［15］ Huang QQ，Bi JL，Sun QY，Yang FM.Bioactive isoquinoline alkaloids from Corydalis saxicola［J］.Planta Med，2012，78（1）：65－70.

［16］ 李倩霞，蔣林，楊得坡，等.大孔吸附樹脂分離巖黃連總生物堿的研究［J］.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2009，40（10）：750－754.

［17］ 王靜，陸兔林，毛春芹，等.巖黃連藥材的提取工藝研究［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，29（3）：360－363.

［18］ 蔣偉哲，莫長(zhǎng)林，黃興振，等.制備色譜系統(tǒng)從巖黃連中分離巖黃連堿［J］.中草藥，2006，37（7）：1017－1019.

［19］ 劉朝亮，程軒軒.高速逆流色譜法制備巖黃連中的脂溶性生物堿［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（17）：3027－3028.

［20］ Deng J，Xiao X，Li G，Ruan G.Application of microwave－assisted extraction coupled with high－speed counter－current chromatography for separation and purification of dehydrocavidine from Corydalis saxicola Bunting［J］.Phytochem Anal，2009，20（6）：498－502.

［21］ 梁鎮(zhèn)然，蔡銳燕，蔣林，等.高速逆流色譜與硅膠柱層析聯(lián)用分離巖黃連中的2種原小檗堿型季胺生物堿［J］.分析試驗(yàn)室，2012，31（1）：98－101.

［22］ 陸益，黃其春，黎遠(yuǎn)冬.HPLC法測(cè)定巖黃連中不同部位脫氫卡維丁的含量［J］.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，27（1）：18－20.

［23］ 羅遠(yuǎn)秀，文東旭.HPLC測(cè)定巖黃連注射液中巖黃連堿的含量［J］.藥物分析雜志，2007，27（6）：904－906.

［24］ 黃雪梅，黃興振，劉雪萍，等.巖黃連片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中國(guó)藥房，2007，18（12）：916－918.

［25］ 程華，余龍江，胡瓊月，等.分光光度法測(cè)定巖黃連不同部位總生物堿的含量［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17（3）：364－365.

［26］ 龔志強(qiáng)，謝麗莎，黃茂春.HPLC測(cè)定廣西4個(gè)產(chǎn)地野生巖黃連藥材中脫氫卡維丁的含量［J］.中國(guó)醫(yī)藥指南，2013，11（3）：480－481.