表觀遺傳學(xué)與糖尿病腎病的研究進(jìn)展①

呂俊，高家林，王李卓

（皖南醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院內(nèi)分泌科，安徽 蕪湖 241002 E－mail：2802654657＠qq.com）

遺傳學(xué)是指基于基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化，如基因突變、基因雜合丟失和微衛(wèi)星不穩(wěn)定等；而表觀遺傳學(xué)則是指基于非基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化，如DNA甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象變化等。表觀遺傳學(xué)（epigenetics）這一概念最早在1942年由康拉德·哈爾·沃丁頓提出，認(rèn)為基因型通過一些偶然的、不確定的機(jī)制決定了不同的表型，并指出表觀遺傳與遺傳是相對(duì)的。主要研究基因型和表型的關(guān)系。幾十年后，霍利迪對(duì)這個(gè)內(nèi)容作了補(bǔ)充和完善。即表觀遺傳學(xué)是基因的DNA序列不發(fā)生改變的前提下，基因的表達(dá)水平和功能發(fā)生改變，并產(chǎn)生可以遺傳的表型。主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、微小RNA干擾等。其與腫瘤、糖尿病、心血管、代謝綜合征等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

糖尿病是世界第三大慢性疾病，嚴(yán)重危害著人類健康。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人均壽命的延長，我國糖尿病的患病率正在急劇增高，預(yù)計(jì)到2025年，我國糖尿病患者總數(shù)可能達(dá)到1億人左右。糖尿病腎病是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥。其發(fā)生率可達(dá)20%～50%之多。糖尿病腎病是糖尿病患者高死亡率的重要原因之一［1］。值得注意的是糖毒作用后即使血糖控制在正常范圍，糖尿病腎臟的病變依然持續(xù)進(jìn)展，而早期強(qiáng)化血糖控制則可產(chǎn)生持久的效益，這一現(xiàn)象被稱為“代謝記憶”［2］或者“遺留效應(yīng)”［3］。

正常情況下，腎小球細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的合成及降解與腎小球毛細(xì)血管叢的再生及修復(fù)保持一種高度協(xié)調(diào)，它受各種細(xì)胞因子、蛋白酶及抑制因子的調(diào)控，是一個(gè)復(fù)雜的過程。任何一個(gè)環(huán)節(jié)的細(xì)微變化均可導(dǎo)致腎小球中ECM的合成與降解失衡從而出現(xiàn)腎小球基質(zhì)膜的破壞和ECM的堆積，導(dǎo)致腎小球的硬化。腎小球硬化是腎小球損傷的結(jié)局，而高血糖無疑是上述病變形成的始動(dòng)因素之一。糖尿病腎病相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)及其功能的闡明將為糖尿病腎病的早期診斷、基因治療提供有效的手段。即使血糖控制在理想狀態(tài)下，其炎癥仍能持續(xù)發(fā)生，間質(zhì)化繼續(xù)加重。提示存在“代謝記憶”，有研究指出可從表觀遺傳學(xué)水平闡明其發(fā)病機(jī)制。

1 DNA甲基化、去甲基化

1.1 DNA甲基化 是目前研究最為深入的表觀遺傳學(xué)機(jī)制之一［4］，它是指S－腺苷甲硫氨酸（SAM）脫去1個(gè)甲基轉(zhuǎn)變?yōu)镾－腺苷同型半胱氨酸（SAH），同時(shí)將該甲基轉(zhuǎn)運(yùn)至胞嘧啶－鳥嘧啶（CpG）二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子（c）上，修飾為5－甲基胞嘧啶（5－mC）。CpG二核苷酸在基因組中出現(xiàn)的頻率較低，但在特定區(qū)域，如基因啟動(dòng)子區(qū)，CpG二核苷酸密集存在，可高達(dá)60%～70%，發(fā)揮調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄作用。DNA甲基化需在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下進(jìn)行。

DNA發(fā)生甲基化后，可以通過以下三個(gè)方面直接或者間接影響該基因的表達(dá)［5］：①通過阻斷轉(zhuǎn)錄起始因子與啟動(dòng)子的結(jié)合直接抑制基因轉(zhuǎn)錄；②可招募甲基化CpG結(jié)合蛋白（methyl－CpG－binding proteins，MBPs），其與5－甲基胞嘧啶結(jié)合后，將進(jìn)一步阻礙轉(zhuǎn)錄起始因子與啟動(dòng)子結(jié)合；③還可招募組蛋白去乙?；感纬蓮?fù)合物，使組蛋白去乙?；?，導(dǎo)致染色質(zhì)聚縮成非活性致密結(jié)構(gòu)，間接抑制基因轉(zhuǎn)錄，參與x染色體沉默、基因印跡、組織特異性基因表達(dá)等生理過程。

1.2 DNA去甲基化 是5－甲基胞嘧啶經(jīng)過一系列反應(yīng)被胞嘧啶所取代的過程。長期以來，一直認(rèn)為去甲基化主要發(fā)生在DNA復(fù)制過程中，是一個(gè)被動(dòng)的過程，然而目前，有關(guān)DNA主動(dòng)去甲基化的機(jī)制被提出［6］。

2 組蛋白修飾

組蛋白修飾是表觀遺傳學(xué)中的另外一項(xiàng)重要的內(nèi)容。組蛋白是真核生物染色體的基本結(jié)構(gòu)蛋白，是一類小分子堿性蛋白質(zhì)［7］。在真核生物體內(nèi)，DNA以環(huán)狀超螺旋形式圍繞在4種核心組蛋白（H2A、H2B、H3、H4）周圍組成核小體，是染色質(zhì)的基本單位。組蛋白H1結(jié)合于核小體間的連接DNA（1inker DNA）上，使核小體成串排列，形成串珠樣結(jié)構(gòu)。組蛋白有兩個(gè)活性末端：即羧基端和氨基端。

核心組蛋白的N末端在物種之間十分保守且易發(fā)生各種類型轉(zhuǎn)錄后修飾，這種常見的組蛋白外在修飾作用包括乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化、ADP核糖基化、羰基化等，它們都是組蛋白密碼的基本元素。該結(jié)構(gòu)不僅利于壓縮和保護(hù)DNA，而且可以保存遺傳信息和控制基因表達(dá)［8］。修飾后的殘基通過兩種途徑影響基因的功能，一是通過改變構(gòu)像或者改變組蛋白電荷而影響核小體－核小體或DNA－核小體相互作用。從而改變?nèi)旧|(zhì)的疏松或者凝集狀態(tài)；二是形成靶點(diǎn)，招募特定蛋白質(zhì)影響轉(zhuǎn)錄過程。

2.1 組蛋白甲基化 主要發(fā)生在賴氨酸和精氨酸側(cè)鏈的氮原子上，其中賴氨酸的甲基化被認(rèn)為是具有穩(wěn)定性和遺傳性。由甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基酶催化完成。甲基轉(zhuǎn)移酶主要有三個(gè)蛋白家族：蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族、SET家族和非SET家族［9］。組蛋白賴氨酸甲基化主要發(fā)生在H3和H4上。組蛋白精氨酸的甲基化和基因的激活密切相關(guān)［10－11］。而 H3、H4精氨酸的去甲基化則可能導(dǎo)致基因沉默。甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基轉(zhuǎn)移酶可以逆轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)組蛋白的甲基化過程，對(duì)基因的表達(dá)起著決定性的作用［12］。譬如：轉(zhuǎn)甲基酶set7／9可能與RNA聚合酶II相互作用共同調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞的基因表達(dá)；賴氨酸4和賴氨酸36發(fā)生的組蛋白H3甲基化，常使常染色質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松伴隨轉(zhuǎn)錄能力的增強(qiáng)，但是賴氨酸9和27發(fā)生的組蛋白H3的甲基化則使染色體的結(jié)構(gòu)致密，并伴隨有基因的沉默［13］。

2.2 組蛋白的乙?；?組蛋白的乙酰化主要發(fā)生在H3和H4的N端的賴氨酸位點(diǎn)上，主要由乙酰轉(zhuǎn)移酶和去乙酰轉(zhuǎn)移酶協(xié)調(diào)進(jìn)行。乙酰轉(zhuǎn)移酶可以使組蛋白賴氨酸的相關(guān)位點(diǎn)乙酰化減弱組蛋白和DNA結(jié)合的能力，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。去乙?；缚梢允菇M蛋白去乙?；鰪?qiáng)組蛋白與DNA結(jié)合能力，抑制轉(zhuǎn)錄。譬如賴氨酸殘基的乙?；彩悄壳傲私獾谋容^清楚的一個(gè)過程［14］，乙?；蟮腄NA結(jié)構(gòu)變得松散使轉(zhuǎn)錄因子易于結(jié)合上去，這一過程往往伴隨DNA的轉(zhuǎn)錄活化［15］，這一修飾過程同時(shí)又可以被組蛋白去乙?；杆孓D(zhuǎn)。這些修飾作用由修飾位點(diǎn)和修飾程度所決定，或互相協(xié)同或互相拮抗，動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。

3 糖尿病腎病與表觀遺傳修飾

無論1型還是2型糖尿病都可顯著加速微血管的病變從而引發(fā)并發(fā)癥如糖尿病腎病。涉及其中的主要事件包括免疫調(diào)控炎癥因子的表達(dá)，糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）的生成，多元醇和氨基己糖代謝途徑及PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活等［16－17］。Wren等［18］通過 Data－Mining分析羅列了引起糖尿病及其并發(fā)癥的諸多因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)“甲基化”和“染色質(zhì)”的統(tǒng)計(jì)得分最高，表明機(jī)體的表觀遺傳修飾是糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要原因。

3.1 DNA甲基化與糖尿病腎病 表觀遺傳因素在基因和環(huán)境之間起到調(diào)節(jié)作用，并影響糖尿病及其并發(fā)癥。Bell等［19］測(cè)定了兩組高加索人外周血甲基化水平（分別為糖尿病組和正常組），發(fā)現(xiàn)兩組的DNA甲基化水平有著明顯的差異。也有研究表明DNA甲基化修飾可能是糖尿病的早期事件。最新研究對(duì)唾液中提取的DNA基因進(jìn)行甲基化水平測(cè)定，發(fā)現(xiàn)糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）不同的發(fā)展階段 DNA 的甲基化差異顯著，根據(jù)DN的發(fā)展階段分成兩組，一組是糖尿病終末期腎病與另外一組是無腎臟并發(fā)癥的糖尿病患者組。發(fā)現(xiàn)此兩組至少有兩個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化存在著明顯的差異［20］。有學(xué)者進(jìn)一步指出糖尿病大鼠腎組織內(nèi)CpG二核苷酸C堿基處的DNA甲基化模式發(fā)生改變，并伴隨DNA甲基化酶、RNA聚合酶的活性下降。并且通過高通量分析DNA甲基化確定了至少19個(gè)CpG位點(diǎn)與DN的發(fā)生密切相關(guān)，但在1型糖尿病患者中，糖尿病相關(guān)基因UNC13B則出現(xiàn)了DNA的高甲基化。這說明DNA的甲基化在DN中的作用機(jī)制以及作用模式比較復(fù)雜。在新近的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)糖尿病患者血清白細(xì)胞介素17（interleukin－17，IL－17）、白細(xì)胞介素6（interleukin－6，IL－6）、超敏CRP（hypersensitive C－ractive protein，hsCRP）等炎癥因子明顯高于健康組（P＜0.05），且糖尿病腎病組顯著高于單純糖尿病組（P＜0.05）［21］。從表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域探索機(jī)制，采用甲基化特異性PCR技術(shù)（Methyl－specific PCR，MSP）檢測(cè)大鼠主動(dòng)脈各炎癥因子基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平，結(jié)果顯示糖尿病組IL－17、IL－6、腫瘤壞死因子α（TNF－α）等基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化水平顯著低于正常組，并與mRNA和蛋白的表達(dá)水平成負(fù)相關(guān)。上述研究提示高糖誘導(dǎo)基因組DNA甲基化水平改變致炎性基因高表達(dá)可能是糖尿病腎病病變一個(gè)潛在原因［18］。

3.2 組蛋白修飾與糖尿病腎病 組蛋白修飾是表觀遺傳學(xué)中的另一項(xiàng)重要的內(nèi)容。其在糖尿病腎病的發(fā)病過程中也扮演著重要的角色。目前對(duì)于糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制存在一個(gè)共識(shí)，即DN患者的腎臟血管發(fā)生了炎癥改變。與單純的糖尿病人相比，炎癥因子均有不同程度的升高。NF－ΚB是DN炎癥通路的重要因子之一。當(dāng)機(jī)體處于高糖狀態(tài)或者血糖控制不佳時(shí)，NF－ΚB的含量明顯升高［17］。繼而可以募集炎癥細(xì)胞在腎臟血管壁聚集并活化下游的炎癥因子，從而造成腎臟的血管炎性損傷，繼而出現(xiàn)臨床癥狀。Sayyed等［22］將暴露于高糖環(huán)境的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的染色質(zhì)免疫提純，發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶Set7富集于NF－KB p65基因的啟動(dòng)子區(qū)激活轉(zhuǎn)錄，當(dāng)小干擾RNA（small interferingRNA，siRNA）使Set7沉默或敲除時(shí)，高糖無法誘導(dǎo)NF－KB p65基因的高表達(dá)［23］。Set7為特異性的單甲基化酶靶向作用于組蛋白賴氨酸4（H3K4）［24］，表明高糖致NF－KB表達(dá)增加可能是通過Set7催化H3K4ml實(shí)現(xiàn)的。

腎臟細(xì)胞外基質(zhì)過度蓄積和腎小管上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)型將導(dǎo)致腎臟纖維化，而腎臟纖維化和DN發(fā)病密切相關(guān)。組蛋白去乙酰酶決定了組蛋白乙?；癄顟B(tài)，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明，組蛋白去乙酰酶－2的活性在糖尿病模型大鼠中明顯增強(qiáng)。并且還發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙酰酶抑制劑能明顯減少細(xì)胞外基質(zhì)的mRNA和蛋白的表達(dá)，并能防止腎小管上皮細(xì)胞上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)型。同時(shí)在正常大鼠的腎小管上皮細(xì)胞中用RNA干擾的方法是組蛋白去乙酰酶－2基因沉默后纖維連接蛋白的mRNA的表達(dá)水平有所減少［25］。

4 結(jié)語

近年來，表觀遺傳學(xué)對(duì)糖尿病腎病的具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究，但是已日益受到中外學(xué)者的重視，而且有可能成為未來治療策略的理論基礎(chǔ)。從理論上講表觀遺傳學(xué)不僅可以揭示糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制，而且表觀遺傳藥物具有比傳統(tǒng)藥物更高的治療潛力和較低的不良反應(yīng)?，F(xiàn)在各種表觀遺傳藥物，如DNA甲基化抑制劑等正在不同程度的研究中。我們相信在征服糖尿病腎病的道路上，表觀遺傳學(xué)將成為最有利最可靠的工具之一。

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